पूल shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग कारकों की पहचान करने के लिए जो एक दवा प्रतिरोध फेनोटाइप को संशोधित करते हैं
Summary
उच्च-थ्रूपुट आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीनिंग लेंटिवायरल shrnas के एक पूल का उपयोग करके दुर्दमताओं में चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सिंथेटिक घातक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक उपकरण हो सकता है। हम तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में एपिजेनेटिक प्रभावकों की जांच करने के लिए एक पूल किए गए shRNA स्क्रीनिंग दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
Abstract
अधिग्रहित कीमो-प्रतिरोध के नैदानिक रूप से प्रासंगिक चालक तंत्र को समझना प्रतिरोध को दरकिनार करने और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) वाले रोगियों में अस्तित्व में सुधार करने के तरीकों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। ल्यूकेमिया कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश जो कीमोथेरेपी से बचजाता है, में कीमोथेरेपी अपमान को सहन करने के लिए एक तैयार एपिजेनेटिक स्थिति होती है। कीमोथेरेपी के लिए आगे के संपर्क में इन दवा persister कोशिकाओं को एक निश्चित epigenetic राज्य प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन दवा प्रतिरोधी आबादी का प्रसार होता है और अंततः पुनरावृत्ति या दुर्दम्य रोग होता है। इसलिए, एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन की पहचान करना जो दवा प्रतिरोधी ल्यूकेमिया कोशिकाओं के अस्तित्व की आवश्यकता होती है, महत्वपूर्ण है। हम एपिजेनेटिक मॉड्यूलेटर की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं जो एक अधिग्रहित साइटाराबिन-प्रतिरोधी एएमएल सेल लाइन में पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग का उपयोग करके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग साइटाराबिन (AraC) के प्रतिरोध की मध्यस्थता करते हैं। पुस्तकालय में 5,485 shRNA निर्माण शामिल हैं जो 407 मानव एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करते हैं, जो उच्च-थ्रूपुट एपिजेनेटिक कारक स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।
Introduction
तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में चिकित्सीय विकल्प लगभग पिछले पांच दशकों से अपरिवर्तित रहे हैं, जिसमें साइटाराबिन (एआरसी) और एंथ्रासाइक्लिन बीमारी के इलाज के लिए आधारशिला के रूप में हैं। एएमएल थेरेपी की सफलता के लिए चुनौतियों में से एक कीमोथेरेपी के लिए ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का प्रतिरोध है, जिससे रोगरिलैप्स 1,2 हो सकता है। एपिजेनेटिक विनियमन कैंसर रोगजनन और दवा प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और कई एपिजेनेटिक कारक आशाजनक चिकित्सीयलक्ष्यों 3,4,5 के रूप में उभरे हैं। एपिजेनेटिक नियामक तंत्र कीमोथेरेपी दवाओं के निरंतर संपर्क में प्रसार और अस्तित्व को प्रभावित करते हैं। गैर-हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में अध्ययन से पता चला है कि दवा के प्रभाव को दूर करने वाली कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश विभिन्न एपिजेनेटिक्स संशोधनों से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप उन कोशिकाओं का अस्तित्व 6,7 होता है। हालांकि, एएमएल में साइटाराबिन के लिए अधिग्रहित प्रतिरोध की मध्यस्थता में एपिजेनेटिक कारकों की भूमिका का पता नहीं लगाया गया है।
उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दवा की खोज के लिए एक दृष्टिकोण है जिसने समय के साथ वैश्विक महत्व प्राप्त किया है और सेलुलर तंत्र में संभावित लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विभिन्न पहलुओं में एक मानक विधि बन गई है, मार्ग प्रोफाइलिंग के लिए, और आणविक स्तर पर 8,9। सिंथेटिक घातकता अवधारणा में दो जीनों के बीच बातचीत शामिल है जहां अकेले जीन की गड़बड़ी व्यवहार्य है, लेकिन दोनों जीनों के परिणामस्वरूप एक साथ व्यवहार्यता10 का नुकसान होता है। कैंसर के उपचार में सिंथेटिक घातकता का शोषण करने से मजबूत सिंथेटिक घातक आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने और यांत्रिक रूप से चिह्नित करने में मदद मिल सकतीहै। हमने एएमएल में अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार एपिजेनेटिक कारकों की पहचान करने के लिए सिंथेटिक घातकता के साथ उच्च-थ्रूपुट shRNA स्क्रीनिंग का एक संयुक्त दृष्टिकोण अपनाया है।
मिश्रित-वंश ल्यूकेमिया जीन (एमएलएल या केएमटी 2 ए) के क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन द्वारा संचालित तीव्र ल्यूकेमिया को रोगियों में खराब अस्तित्व से जुड़ा होने के लिए जाना जाता है। एमएलएल जीन पुनर्व्यवस्था के परिणामी चिमेरिक उत्पाद, यानी, एमएलएल संलयन प्रोटीन (एमएलएल-एफपी), हेमटोपोइएटिक स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) को कई एपिजेनेटिक कारकों की भागीदारी के साथ ल्यूकेमिया विस्फोटों में बदल सकते हैं। ये एपिजेनेटिक नियामक एक जटिल नेटवर्क का गठन करते हैं जो ल्यूकेमिया कार्यक्रम के रखरखाव को निर्देशित करता है और इसलिए, संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बना सकता है। इस संदर्भ में, हमने अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोधी सेल लाइन को विकसित करने के लिए एमवी 4-11 सेल लाइन (एमएलएल संलयन जीन एमएलएल-एएफ 4 को एफएलटी 3-आईटीडी उत्परिवर्तन के साथ हार्बरिंग; एमवी 4-11 पी के रूप में जाना जाता है; जिसे एमवी 4-11 एआरसी आर के रूप में जाना जाता है) का उपयोग किया। सेल लाइन को दवा के उपचार से आंतरायिक वसूली के साथ साइटाराबिन की बढ़ती खुराक के संपर्क में लाया गया था, जिसे दवा की छुट्टी के रूप में जाना जाता है। आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) इन विट्रो cytotoxicity परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
हम एक pZIP lentiviral रीढ़ के साथ hEF1a प्रमोटर द्वारा संचालित pooled epigenetic shRNA पुस्तकालय (सामग्री की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय में 407 एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करने वाले एसएचआरएनए शामिल हैं। प्रत्येक कारक में 5-24 shrnas हैं, जिसमें कुल 5,485 shrnas हैं, जिसमें पांच गैर-लक्षित नियंत्रण shrnAs शामिल हैं। संशोधित “UltrmiR” miR-30 पाड़ कुशल प्राथमिक shRNA biogenesis और अभिव्यक्ति12,13 के लिए अनुकूलित किया गया है।
इस प्रयोग की रूपरेखा को चित्र 1A में दर्शाया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल MV4-11 AraC R सेल लाइन (चित्रा 1B), एक निलंबन सेल लाइन में epigenetic कारक shRNA पुस्तकालय का उपयोग करके RNAI स्क्रीनिंग पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी की पसंद के किसी भी दवा-प्रतिरोधी सेल लाइन में किसी भी लक्षित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल अनुयायी कोशिकाओं के लिए अलग होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) का बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें एसआईआरएनए और एसआरएनए स्क्रीनिंग शामिल हैं। SHRNA का लाभ यह है कि उन्हें प्लास्मिड वैक्टर में शाम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा भाग में वित्त पोषित किया जाता है, जो एसआरवी को बीटी / पीआर 8742 / एजीआर / 36 / 773 / 2013 अनुदान देता है; और जैव प्रौद्योगिकी विभाग भारत बीटी / सीओई / 34 / एसपी 13432 / 2015 और विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग, भारत: ईएमआर / 2017 / 003880 से पी.B आरवीएस और पी.B क्रमशः वेलकम डीबीटी इंडिया एलायंस आईए / एस / 17 / 1 / 503118 और आईए / एस / 15 / 1 / 501842 द्वारा समर्थित हैं। एसडी सीएसआईआर-यूजीसी फैलोशिप द्वारा समर्थित है, और एसआई को आईसीएमआर वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। हम अभिरूप बागची, सांद्या रानी और सीएससीआर फ्लो साइटोमेट्री कोर फैसिलिटी स्टाफ को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण में मदद करने के लिए मेडजीनोम इंक को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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