Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren
Summary
High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA’s kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.
Abstract
Het begrijpen van klinisch relevante drivermechanismen van verworven chemoresistentie is cruciaal voor het ophelderen van manieren om resistentie te omzeilen en de overleving te verbeteren bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Een klein deel van de leukemische cellen die chemotherapie overleven, hebben een geschikte epigenetische toestand om chemotherapeutische belediging te tolereren. Verdere blootstelling aan chemotherapie stelt deze medicijn persistercellen in staat om een vaste epigenetische toestand te bereiken, wat leidt tot veranderde genexpressie, wat resulteert in de proliferatie van deze medicijnresistente populaties en uiteindelijk terugval of refractaire ziekte. Daarom is het identificeren van epigenetische modulaties die de overleving van medicijnresistente leukemische cellen noodzakelijk maken, van cruciaal belang. We beschrijven een protocol om epigenetische modulatoren te identificeren die resistentie tegen het nucleoside analoge cytarabine (AraC) bemiddelen met behulp van gepoolde shRNA-bibliotheekscreening in een verworven cytarabine-resistente AML-cellijn. De bibliotheek bestaat uit 5.485 shRNA-constructies gericht op 407 menselijke epigenetische factoren, die epigenetische factorscreening met hoge doorvoer mogelijk maken.
Introduction
Therapeutische opties bij acute myeloïde leukemie (AML) zijn de afgelopen vijf decennia onveranderd gebleven, met cytarabine (AraC) en anthracyclines als hoeksteen voor de behandeling van de ziekte. Een van de uitdagingen voor het succes van AML-therapie is de resistentie van leukemische stamcellen tegen chemotherapie, wat leidt tot terugval van de ziekte 1,2. Epigenetische regulatie speelt een vitale rol in de pathogenese van kanker en resistentie tegen geneesmiddelen, en verschillende epigenetische factoren zijn naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische doelen 3,4,5. Epigenetische regulerende mechanismen beïnvloeden proliferatie en overleving bij continue blootstelling aan chemotherapeutische geneesmiddelen. Studies in niet-hematologische maligniteiten hebben gemeld dat een klein deel van de cellen die het geneesmiddeleffect overwinnen verschillende epigenetische modificaties ondergaan, wat resulteert in de overleving van die cellen 6,7. De rol van epigenetische factoren bij het bemiddelen van verworven resistentie tegen cytarabine in AML is echter niet onderzocht.
High-throughput screening is een benadering van geneesmiddelenontdekking die in de loop van de tijd wereldwijd aan belang heeft gewonnen en in verschillende aspecten een standaardmethode is geworden om potentiële doelen in cellulaire mechanismen, voor routeprofilering en op moleculair niveaute identificeren 8,9. Het concept van synthetische letaliteit omvat de interactie tussen twee genen waarbij de verstoring van een van beide genen alleen levensvatbaar is, maar van beide genen tegelijkertijd resulteert in het verlies van levensvatbaarheid10. Het benutten van synthetische letaliteit bij de behandeling van kanker kan helpen bij het identificeren en mechanistisch karakteriseren van robuuste synthetische dodelijke genetische interacties11. We hebben een combinatorische benadering van high-throughput shRNA-screening met synthetische letaliteit aangenomen om de epigenetische factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor verworven cytarabineresistentie in AML.
Van acute leukemieën gedreven door chromosomale translocatie van het gemengde-afstammingsleukemiegen (MLL of KMT2A) is bekend dat ze geassocieerd zijn met een slechte overleving bij patiënten. De resulterende chimere producten van MLL-genherschikkingen, d.w.z. MLL-fusie-eiwitten (MLL-FPs), kunnen hematopoëtische stam- / voorlopercellen (HSPC’s) transformeren in leukemische blasten met de betrokkenheid van meerdere epigenetische factoren. Deze epigenetische regulatoren vormen een ingewikkeld netwerk dat het onderhoud van het leukemieprogramma dicteert en daarom potentiële therapeutische doelen kan vormen. In deze context gebruikten we de MV4-11 cellijn (met het MLL-fusiegen MLL-AF4 met de FLT3-ITD-mutatie; aangeduid als MV4-11 P) om de verworven cytarabine-resistente cellijn te ontwikkelen, aangeduid als MV4-11 AraC R. De cellijn werd blootgesteld aan toenemende doses cytarabine met intermitterend herstel van de medicamenteuze behandeling, bekend als een drugsvakantie. De half-maximale remmende concentratie (IC50) werd beoordeeld met behulp van een in vitro cytotoxiciteitstest.
We gebruikten de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek (zie Tabel met materialen) aangedreven door de hEF1a-promotor met een pZIP lentiviral backbone. Deze bibliotheek bestaat uit shRNA’s die zich richten op 407 epigenetische factoren. Elke factor heeft 5-24 shRNA’s, met een totaal van 5.485 shRNA’s, waaronder vijf niet-gerichte controle-shRNA’s. De gemodificeerde “UltrmiR” miR-30 scaffold is geoptimaliseerd voor efficiënte primaire shRNA biogenese en expressie12,13.
De contouren van dit experiment zijn geïllustreerd in figuur 1A. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van de epigenetische factor shRNA-bibliotheek in de MV4-11 AraC R-cellijn (figuur 1B), een suspensiecellijn. Dit protocol kan worden gebruikt om elke gerichte bibliotheek in elke medicijnresistente cellijn naar keuze te screenen. Opgemerkt moet worden dat het transductieprotocol anders zal zijn voor adherente cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-interferentie (RNAi) wordt veel gebruikt voor functionele genomicastudies, waaronder siRNA- en shRNA-screening. Het voordeel van shRNA is dat ze kunnen worden opgenomen in plasmidevectoren en kunnen worden geïntegreerd in genomisch DNA, wat resulteert in stabiele expressie en dus langdurigere knockdown van het doelmRNA. Een gepoolde shRNA-bibliotheekscreening is robuust en kosteneffectief in vergelijking met de conventionele arrayed screens (siRNA). Het identificeren van de essentialiteit van een specifieke klasse e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van het Department of Biotechnology BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 aan SRV; en Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 en Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS en P.B. worden ondersteund door respectievelijk Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 en IA/S/15/1/501842. S.D. wordt ondersteund door de CSIR-UGC fellowship, en S.I. wordt ondersteund door een ICMR senior research fellowship. We bedanken Abhirup Bagchi, Sandya Rani en het personeel van de CSCR Flow Cytometry Core Facility voor hun hulp. We bedanken ook MedGenome Inc. voor het helpen met de high-throughput sequencing en data-analyse.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
