Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments
Summary
Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).
Abstract
Comprendre les mécanismes pilotes cliniquement pertinents de la chimio-résistance acquise est crucial pour élucider les moyens de contourner la résistance et d’améliorer la survie chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). Une petite fraction des cellules leucémiques qui survivent à la chimiothérapie ont un état épigénétique posé pour tolérer l’insulte chimiothérapeutique. Une exposition supplémentaire à la chimiothérapie permet à ces cellules persistantes d’atteindre un état épigénétique fixe, ce qui entraîne une altération de l’expression des gènes, entraînant la prolifération de ces populations résistantes aux médicaments et éventuellement une rechute ou une maladie réfractaire. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les modulations épigénétiques qui nécessitent la survie des cellules leucémiques résistantes aux médicaments. Nous détaillons un protocole pour identifier les modulateurs épigénétiques qui médient la résistance à la cytarabine analogue nucléosidique (AraC) en utilisant le criblage de la bibliothèque shRNA regroupée dans une lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine. La bibliothèque se compose de 5 485 constructions d’ARNh ciblant 407 facteurs épigénétiques humains, ce qui permet un criblage de facteurs épigénétiques à haut débit.
Introduction
Les options thérapeutiques dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) sont restées inchangées au cours des cinq dernières décennies, avec la cytarabine (AraC) et les anthracyclines comme pierre angulaire du traitement de la maladie. L’un des défis au succès du traitement de la LAM est la résistance des cellules souches leucémiques à la chimiothérapie, entraînant une rechute de la maladie 1,2. La régulation épigénétique joue un rôle vital dans la pathogenèse du cancer et la résistance aux médicaments, et plusieurs facteurs épigénétiques sont apparus comme des cibles thérapeutiques prometteuses 3,4,5. Les mécanismes de régulation épigénétique affectent la prolifération et la survie en cas d’exposition continue à des médicaments chimiothérapeutiques. Des études sur les tumeurs malignes non hématologiques ont rapporté qu’une petite fraction des cellules qui surmontent l’effet du médicament subissent diverses modifications épigénétiques, ce qui entraîne la survie de ces cellules 6,7. Cependant, le rôle des facteurs épigénétiques dans la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM n’a pas été exploré.
Le criblage à haut débit est une approche de la découverte de médicaments qui a acquis une importance mondiale au fil du temps et est devenue une méthode standard dans différents aspects pour identifier des cibles potentielles dans les mécanismes cellulaires, pour le profilage des voies et au niveau moléculaire 8,9. Le concept de létalité synthétique implique l’interaction entre deux gènes où la perturbation de l’un ou l’autre gène seul est viable mais des deux gènes entraîne simultanément la perte de viabilité10. L’exploitation de la létalité synthétique dans le traitement du cancer pourrait aider à identifier et à caractériser mécaniquement des interactions génétiques létales synthétiques robustes11. Nous avons adopté une approche combinatoire de criblage d’ARNh à haut débit avec létalité synthétique pour identifier les facteurs épigénétiques responsables de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM.
Les leucémies aiguës provoquées par la translocation chromosomique du gène de la leucémie mixte (MLL ou KMT2A) sont connues pour être associées à une faible survie chez les patients. Les produits chimériques résultants des réarrangements du gène MLL , c’est-à-dire les protéines de fusion MLL (MLL-FP), peuvent transformer les cellules souches /progénitrices hématopoïétiques (HSPC) en blastes leucémiques avec l’implication de multiples facteurs épigénétiques. Ces régulateurs épigénétiques constituent un réseau complexe qui dicte le maintien du programme de leucémie et, par conséquent, pourrait former des cibles thérapeutiques potentielles. Dans ce contexte, nous avons utilisé la lignée cellulaire MV4-11 (hébergeant le gène de fusion MLL MLL-AF4 avec la mutation FLT3-ITD; appelée MV4-11 P) pour développer la lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine, appelée MV4-11 AraC R. La lignée cellulaire a été exposée à des doses croissantes de cytarabine avec une récupération intermittente du traitement médicamenteux, connue sous le nom de vacances médicamenteuses. La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été évaluée par un test de cytotoxicité in vitro .
Nous avons utilisé la bibliothèque d’ARNh épigénétique groupée (voir Tableau des matériaux) pilotée par le promoteur hEF1a avec une colonne vertébrale lentivirale pZIP. Cette bibliothèque comprend des shRNA ciblant 407 facteurs épigénétiques. Chaque facteur a 5 à 24 shRNA, avec un total de 5 485 shRNA, dont cinq shRNA de contrôle non ciblés. L’échafaudage miR-30 modifié « UltrmiR » a été optimisé pour une biogenèse et une expression efficaces de l’ARNh primaire12,13.
Les grandes lignes de cette expérience sont illustrées à la figure 1A. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R (Figure 1B), une lignée cellulaire en suspension. Ce protocole peut être utilisé pour dépister n’importe quelle bibliothèque ciblée dans n’importe quelle lignée cellulaire résistante aux médicaments de son choix. Il convient de noter que le protocole de transduction sera différent pour les cellules adhérentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’interférence ARN (ARNi) est largement utilisée pour les études de génomique fonctionnelle, qui comprennent le criblage du siRNA et du shRNA. L’avantage des shRNA est qu’ils peuvent être incorporés dans des vecteurs plasmidiques et intégrés dans l’ADN génomique, ce qui entraîne une expression stable et, par conséquent, une destruction plus prolongée de l’ARNm cible. Un criblage de bibliothèque d’ARNh groupé est robuste et rentable par rapport aux écrans en réseau conventionnels (siRNA). Ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est financée en partie par une subvention du Département de biotechnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; et Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 et Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS et P.B. sont soutenus par Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 et IA/S/15/1/501842, respectivement. S.D. est soutenu par la bourse CSIR-UGC, et S.I. est soutenu par une bourse de recherche senior ICMR. Nous remercions Abhirup Bagchi, Sandya Rani et le personnel de l’installation centrale de cytométrie en flux du CSCR pour leur aide. Nous remercions également MedGenome Inc. pour son aide dans le séquençage à haut débit et l’analyse des données.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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