本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台——cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，构建一个适用于多种单颗粒数据集的单一且稳健的工作流程，以实现高分辨率结构解析。
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方法文章
一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程
本文内容
摘要
摘要
近年来，仪器设备和图像处理软件的不断进步已使单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）成为结构生物学家解析多种大分子高分辨率结构的首选方法。目前有多个软件套件可供新手和专家用户进行图像处理与结构计算，这些软件均遵循相似的基本流程：显微镜探测器采集的原始电影数据首先进行辐照诱导运动校正和对比度传递函数（CTF）估计；随后，从校正后的电影帧平均图像中选取并提取颗粒图像，进行迭代式的二维和三维分类，继而完成三维重构、精修与验证。由于不同软件包采用的算法各异，且操作所需的专业水平不同，其生成的三维图谱在质量和分辨率上常存在差异。因此，用户通常需要在多个程序之间转换数据，以获得最优结果。本文旨在为用户提供一份操作指南，介绍如何在常用软件平台 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 之间构建连贯的工作流程，以解析腺相关病毒（AAV）的近原子分辨率结构。我们首先详细描述使用 cryoSPARC v3 的图像处理流程，因其高效的算法和用户友好的图形界面可帮助用户快速获得三维图谱。接下来，利用 PyEM 工具及自研脚本，将 cryoSPARC v3 中获得的最佳质量三维重构所对应的颗粒坐标转换并导入 RELION-3 和 Scipion 3，并重新计算三维图谱。最后，我们概述如何结合 RELION-3 和 Scipion 3 中的算法，对所得结构进行进一步精修与验证。本文阐述了如何有效整合三个处理平台，构建统一且稳健的工作流程，适用于多种数据集的高分辨率结构解析。
引言
冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）与单颗粒分析（SPA）能够解析多种生物大分子复合体在水合状态下的结构，有助于在原子水平上阐明这些大分子的功能。显微镜光学系统、计算机硬件以及图像处理软件的进步，使得生物大分子结构的分辨率已达到2 Å以下1,2,3。2020年，共有超过2,300个cryo-EM结构被提交至蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB），而2014年仅为192个4，表明cryo-EM已成为许多结构生物学家的首选方法。本文介绍了一种结合三种不同单颗粒分析程序的工作流程，用于高分辨率结构解析（图1）。
单颗粒分析（SPA）的目标是从显微镜探测器记录的含噪声二维图像中重建目标样品的三维结构。探测器以电影形式采集图像，其中每一帧均为同一视野的图像。为了保护样品，各帧图像采用低电子剂量采集，因此信噪比（SNR）较低。此外，电子束照射可能引起玻璃态冷冻电镜载网内部的运动，导致图像模糊。为克服这些问题，需对各帧图像进行对齐以校正电子束诱导的运动，并通过平均化处理获得信噪比提升的显微照片。随后，对这些显微照片进行对比度传递函数（CTF）估计，以校正显微镜所引入的离焦和像差....
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方案
1. 创建新的 cryoSPARC v3 项目并导入数据
注意：数据由位于波特兰的俄勒冈健康与科学大学（OHSU）使用配备Falcon 3直接电子探测器的300 kV Titan Krios透射电子显微镜采集。图像以计数模式采集，总剂量为28.38 e−/Å2，分129帧采集，欠焦范围为-0.5 µm至-2.5 µm，像素尺寸为1.045 Å，使用EPU软件完成。AAV-DJ样品由OHSU工作人员提供。
- 在网页浏览器中打开 cryoSPARC v3，点击 Projects 标题。选择 + Add 以创建一个新项目。为项目命名，并提供一个现有目录的路径，用于保存作业和数据。
- 通过打开项目，点击 + Add，然后选择 New Workspace 来为该项目创建一个工作区。为工作区命名后点击 Create。
- 进入新创建的工作区，在右侧面板打开 Job Builder。该选项卡显示了 cryoSPARC v3 中所有可用的功能。点击 Import Movies，并提供电影文件路径、增益参考文件路径，以及设置以下....
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结果
我们介绍了一种全面的单颗粒冷冻电镜（SPA）分析流程，该流程使用三种不同的处理平台：cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，以获得高分辨率结构。图1 和 图4 概括了通用的处理工作流程，表1 详细列出了精修所用的实验方案。这些方案在腺相关病毒（AAV）2.3 Å 结构的精修过程中得到应用，最终达到了接近奈奎斯特分辨率的水平。
首先将电影文件导入 cryoSPARC v3，并进行运动校正和CTF校正，以生成平均显微照片。在选择用于后续处理的显微照片时，应优先选取CTF拟合良好且像散较低的图像（图2），因为纳入质量较差的显微照片可能会影响后续处理步骤，导致重构分辨率降低。随后从选定的显微照片中挑选并提取了27,364个颗粒。由于AAV的直径约为220 Å，像素尺寸为1.045 Å，因此采用300像素的盒尺寸。接下来通过迭代的2D分类去除伪影以及未能.......
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讨论
本文介绍了一种稳健的单颗粒分析（SPA）工作流程，适用于多种软件平台的冷冻电镜数据处理，以实现高分辨率三维重构图1）。该工作流程适用于多种生物大分子。本实验方案的后续步骤概述如下 图4，包括电影预处理、颗粒挑选与分类，以及多种结构精修方法（表格 1）以及验证。本文展示了在 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中的处理步骤，以及在不同软件包之间传输数据的方法。我们展示了在整个流程中逐步获得的中间结构及其分辨率的提升情况。图4, 图6 和 图7).
尽管本文所述方法可用于不同蛋白质和生物复合物的结构测定，但需要注意的是，腺相关.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Carlos Oscar Sorzano在Scipion3安装方面提供的帮助，以及Kilian Schnelle和Arne Moeller在不同处理平台间数据传输方面的协助。本研究的部分工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目U24GM129547支持，并在俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的PNCC开展，通过EMSL（grid.436923.9）进行访问；EMSL是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。本研究还得到了罗格斯大学向Arek Kulczyk提供的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | 霍华德·休斯医学研究所，马萨诸塞大学陈医学院 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | 加州大学旧金山分校大分子结构研究组 | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | 大分子中子晶体学计算工具（MNC） | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | 加州大学旧金山分校 | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | 英国医学研究理事会结构生物学实验室 | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct 图像处理中心（I2PC），SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | 加州大学旧金山分校生物计算、可视化与信息学资源中心 | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
参考文献
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M.,
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重印与许可
