Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

بروتوكول نمذجة الأروميات البشرية تطوير وزرع الكيسة الأريمية

Published: August 10, 2022 doi: 10.3791/63388
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,3, 1,3, 2, 1, 1
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

بروتوكول يحدد تكوين الأروميات البشرية التي تولد بكفاءة وفي الوقت المناسب وبالتتابع خلايا تشبه الكيسة الأريمية.

Abstract

ومن شأن نموذج الكيسة الأريمية البشرية المتكون من الخلايا الجذعية (blastoid) أن يدعم التقدم العلمي والطبي. ومع ذلك ، فإن قوتها التنبؤية تعتمد على قدرتها على تلخيص تسلسل تطور الكيسة الأريمية بكفاءة وفي الوقت المناسب وبأمانة (التشكل ، المواصفات ، النمط) ، وتشكيل خلايا تعكس مرحلة الكيسة الأريمية. هنا نظهر أن الخلايا الجذعية البشرية الساذجة متعددة القدرات المستزرعة في ظروف PXGL ثم تثبيطها ثلاث مرات لفرس النهر ، وتحويل عامل النمو - β ، ومسارات كيناز خارج الخلية المنظمة بالإشارة تخضع بكفاءة للتشكل لتشكيل الأروميات (>70٪). مطابقة مع توقيت النمو (~ 4 أيام) ، تقوم الأروميات بفتح تسلسل الكيسة الأريمية للمواصفات عن طريق إنتاج نظائر الأرومة الغاذية و epiblast ، تليها تشكيل نظائر للأديم الباطن البدائي والأرومات الغاذية القطبية. هذا يؤدي إلى تكوين خلايا مشابهة نسخيا للكيسة الأريمية (>96٪) وأقلية من نظائرها بعد الزرع. تنتظم الأروميات بكفاءة عن طريق تشكيل المحور الجنيني غير الجنيني الذي يتميز بنضج المنطقة القطبية (NR2F2 +) ، والذي يكتسب القدرة المحددة على الالتصاق اتجاهيا بخلايا بطانة الرحم المحفزة هرمونيا ، كما هو الحال في الرحم. مثل هذا البلاستويد البشري هو نموذج قابل للتطوير ومتعدد الاستخدامات وأخلاقي لدراسة التنمية البشرية والزرع في المختبر.

Introduction

وقد حد الافتقار إلى النماذج التجريبية من فهم التكوين الجنيني البشري المبكر. تستمد المعرفة الحالية بالجوانب الخاصة بالإنسان من التطور الجنيني من فائض أجنة الإخصاب في المختبر (IVF) المتبرع بها للبحث. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود ، وصعوبات التلاعب التجريبي ، والجودة المتغيرة للأجنة تعيق التحقيقات العلمية. على العكس من ذلك ، فإن النموذج المخلص في المختبر للأجنة البشرية سيسمح بالتلاعب التجريبي المعقد ، وبالتالي توفير فرصة أخلاقية لاستكمال البحث على الأجنة البشرية1،2،3،4. نموذج تم تطويره سابقا من الكيسة الأريمية للفئران يجمع بين الخلايا الجذعية الجنينية للفئران والخلايا الجذعية الأرومة الغاذية5. في هذا البروتوكول المفصل ، يتم وصف طريقة لتوليد نموذج للكيسة الأريمية البشرية من الخلايا الجذعية الساذجة متعددة القدرات المخلصة لمعايير الكيسة الأريمية الأولية6.

أربعة معايير للأروميات البشرية. هنا ، في محاولة لوضع تعريف موحد للأروميات البشرية ، نقترح أربعة معايير دنيا. وعلى الرغم من أن هذه المعايير ليست شاملة، إلا أنها قد تكون بمثابة أساس لتقييم البارامترات التي تسمح بتكوين الأروميات البشرية (الشكل 1 ألف). (1) يجب أن تتشكل الأروميات بكفاءة من حيث التشكل وتوليد نظائرها من السلالات الثلاثة وهي epiblast (Epi) ، trophectoderm (TE) ، والأديم الباطن البدائي (PrE). من المرجح أن يشير عدم الكفاءة إلى حالة خلية أولية غير كافية و / أو حالة استزراع (على سبيل المثال ، وسط الأرومي). (2) يجب أن تولد الأروميات نظائر من السلالات الثلاثة وفقا للتسلسل التنموي (Epi / TE أولا ، PrE / polarTE الأخير) 7,8 والتوقيت (الحث ~ 3 أيام ؛ الأيام الجنينية 5-7) 7,9. (3) يجب أن تشكل الأروميات نظائرها لمرحلة الكيسة الأريمية ، ولكن ليس لمراحل ما بعد الزرع (على سبيل المثال ، الخلايا الأرومة الغاذية أو الخلايا السلوية بعد الزرع). (4) وأخيرا، ينبغي أن تكون الأروميات قادرة على تلخيص السمات الوظيفية لزرع الكيسة الأريمية وتطويرها. باستخدام هذا البروتوكول ، تتشكل الأروميات البشرية بكفاءة باستخدام خطوط خلايا متعددة (>70٪) ، وتكون قادرة على توليد نظائر الكيسة الأريمية الخلوية بالتتابع وفي غضون 4 أيام ، والنظيرات تشبه نسخيا مرحلة الكيسة الأريمية (>96٪ بناء على عدة تحليلات) 6،10،11. وأخيرا، تولد الأروميات بقوة المحور الجنيني الأبجيني، مما يسمح لها بالتفاعل مع خلايا بطانة الرحم المحفزة هرمونيا عبر المنطقة القطبية، وتوسيع السلالات بقوة عند الثقافة الموسعة (ما يعادل الوقت: اليوم الجنيني 13).

أهمية حالة الخلية الأولية. يمكن تثبيت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في حالات مختلفة تحاول التقاط مراحل نمو دقيقة. يتم الحفاظ على هذه الحالات من خلال ظروف الاستزراع التي ، على الرغم من أنها لا تزال دون المستوى الأمثل ، تقيد الخلايا في مرحلة ما قبل الزرع (~ الأيام الجنينية 5-7) أو ما بعد الزرع الشبيهة (~ الأيام الجنينية 8-14) المرحلة12. أظهر التحليل النسخي أن hPSCs المستزرعة في PD0325901 و XAV939 و Gö6983 وعامل تثبيط سرطان الدم (LIF ؛ يطلق عليها اسم PXGL hPSCs الساذجة) 13,14 هي أكثر تشابها مع epiblast الكيسة الأريمية بالمقارنة مع hPSCs المستزرعة في عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 2 و activin 15 (تسمى hPSCs12) والخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الموسعة (hEPSCs)16 (انظر التحليل في المراجع 17 ، 18، 19). وفقا لذلك ، فإن نسخة hPSCs الجاهزة تتطابق بشكل أفضل مع cynomolgus20 بعد الزرع / ما قبل المعدة. أكدت معايير جزيئية إضافية ، مثل تعبير transposon ، ومثيلة الحمض النووي ، وحالة كروموسوم X ، أن الاختلافات في الحالة الساذجة تشبه إلى حد كبير أببلاست الكيسة الأريمية مقارنة بالحالة الجاهزة 17,21. وأخيرا ، تم اشتقاق خطوط hPSCs الساذجة بنجاح مباشرة من الكيسة الأريمية باستخدام ظروف زراعة PXGL22.

خلايا الكيسة الأريمية البشرية المبكرة لم تلتزم بعد. تحدث مواصفات سلالة المورين من مرحلة المورولا التي تسبق مرحلة الكيسة الأريمية23. على العكس من ذلك ، أظهرت تجارب التفكك وإعادة التجميع أن خلايا الأديم التغذي البشري للكيسات الأريمية المبكرة لم يتم ارتكابها بعد24. وبناء على ذلك، أظهر تحليل خلايا الكيسة الأريمية البشرية عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) أن مواصفات السلالة الأولى (الأرومة الغاذية/الأرومة النجمية) تحدث بعد تكوين تجويف الكيسة الأريمية7. ترتبط هذه المواصفات البشرية المؤجلة بالملاحظات التي تفيد بأن hPSCs قوية لتشكيل الأرومات الغاذية25،26،27 عندما تكون PSCs الفئران ملتزمة إلى حد كبير بسلالة epiblast. أدت هذه الملاحظات مجتمعة إلى احتمال أن تعكس hPSCs الساذجة مرحلة الكيسة الأريمية وتحتفظ بإمكانية تشكيل سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح فعالية hPSCs لتحديد نظائرها خارج الجنين للتحول من الأديم التغذي إلى السلى أثناء التقدم من الحالة الساذجة إلى الحالة الجاهزة27. وبالتالي ، فإن hPSCs الساذجة تشبه إلى حد كبير مرحلة ما قبل الزرع 17،18،21 ولديها قدرة معززة على تكوين الأرومة الغاذية مقارنة ب hPSCs 27 ، hEPSCs16 ، أو الحالات المتوسطة المعاد برمجتها 28 ، والتي هي عرضة لتشكيل نظائر ما بعد الزرع 10 (الشكل 1B ). وبالتالي فإن حالة الخلية الأولية حاسمة لتشكيل النظائر خارج الجنين المناسبة. على الرغم من أنه لا يزال يتعين إجراء تحليل شامل جنبا إلى جنب لنظائر الأديم المحول ، إلا أن حالة PXGL الساذجة التي تعكس الكيسة الأريمية المبكرة تبدو مهمة لتشكيل أروميات عالية الدقة.

حث المواصفات والتشكل عن طريق تثبيط مسارات الإشارة. إن تثبيط مسار إشارات فرس النهر هو آلية محفوظة تقود مواصفات الأرومة الغاذية في الفئران والأبقار والبشر9،29،30. أيضا ، منذ عام 2013 ، من المعروف أن تثبيط NODAL (A83-01) وكيناز خارج الخلية المنظمة بالإشارة (ERK; PD0325901 أو ما يعادلها) وتنشيط مسارات إشارات البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) يؤدي إلى تحفيز hPSCs الجاهزة لتنشيط شبكة النسخ المرتبطة بسلالة الأرومة الغاذية 25,31,32,33,34. علاوة على ذلك ، أكدت العديد من التقارير مؤخرا أيضا أن تثبيط كل من مسار NODAL و ERK وتنشيط BMP يسهل تمايز الأرومة الغاذية عن hPSCs الساذجة25،31،32،33،34. أخيرا ، إذا تم تشغيل مواصفات الأرومة الغاذية من حالة ساذجة ، فإن الخلايا تلخص جوانب التقدم التنموي للأديم الغاذ26. ومع ذلك، لم تستقر خطوط التجديد الذاتي التي تعكس الأديم التغذي للأديم الأريمي في المختبر. بعد مواصفات الأرومة الغاذية ، فإن تحريض مسار عامل نمو البشرة (EGF) ومسارات إشارات Wnt جنبا إلى جنب مع تثبيط HDAC قد يسهل التقدم التنموي للأرومة الغاذية34,35 واستقرار الخلايا في خطوط من الخلايا الجذعية للأرومة الغاذبية البشرية (hTSCs) التي تعكس الأرومات الغاذبية الخلوية بعد الزرع 18,35. يمكن اشتقاق هذه الخطوط من كل من الكيسة الأريمية وأنسجة المشيمة35.

يتم تحديد السلالة الثانية خارج الجنين ، والتي تسمى PrE ، بعد الأرومات الغاذية وتنشأ من epiblast 7,9. على عكس الفئران PrE36 ، يعتقد أن النظير البشري مستقل عن إشارات FGF37,38. تم إنشاء خطوط تعكس الأديم الباطن خارج الجنين (تسمى nEnd) من hPSCs الساذجة عن طريق تحريض مسارات الإشارات باستخدام activin A و Wnt و LIF39. غير متسق مع تجارب تثبيط الجنين ، فقد ثبت أن تثبيط ERK يمنع تكوين خلايا nEND هذه في المختبر39. حتى الآن ، لم يتم اشتقاق هذه الخطوط مباشرة من الكيسة الأريمية.

في الآونة الأخيرة ، تم تشكيل نماذج من الجنين المبكر من خلال الجمع بين الاختلافات في الوسائط التي تم تطويرها سابقا لخلايا hTSCs35 و nEND39 وبالتالي استخدام منشطات β عامل النمو المحول (TGF-β) ، EGF ، ومسارات إشارات Wnt28,40. تتشكل نماذج الأجنة هذه بكفاءة منخفضة (10٪ -20٪) وتشكل خلايا تشبه مرحلة ما بعد الزرع بدلا من مرحلة ما قبل الزرع 10 ، بما في ذلك نظائر الأرومة النجمية بعد الزرع ، الأرومة الغاذية ، السلى ، المعدة ، أنسجة الجلد المتوسط (~ اليوم الجنيني 14) ، والأرومات الغاذبيةالخلوية 10. على العكس من ذلك ، فإن التثبيط الثلاثي لمسارات Hippo و ERK و TGF-β يوجه بكفاءة تكوين الأروميات التي تضم خلايا تشبه الكيسة الأريمية41. جنبا إلى جنب مع حالة الخلية الأولية ، نقترح أن تثبيط المسارات الثلاثية (فرس النهر ، ERK ، TGF-β) هو المعلمة الأساسية الثانية لتشكيل الأروميات عالية الدقة (الشكل 1B).

تقييم حالة الخلية والمرحلة المنعكسة باستخدام scRNAseq. يمكن تقييم حالات الخلايا المكونة للأروميات من خلال تحليل scRNAseq. يمكن قياس تشابهها النسخي مع مراحل جنينية محددة باستخدام الخلايا الأريمية وحدها وبالمقارنة مع hPSCs أو hTSCs الجاهزة التي تعكس مراحل ما بعد الزرع20,35. يكشف إجراء تحليلات المجموعات باستخدام مستويات مختلفة من التعريف عن كيفية اندماج المجموعات الفرعية تدريجيا عندما ينخفض التعريف ، وبالتالي الكشف عن أوجه التشابه بين المجموعات. على الرغم من أن الأمثل في عدد المجموعات يمكن قياسه42 ، إلا أن التجمعات عالية الدقة تبلغ أيضا عن الوجود النهائي لمجموعات فرعية صغيرة غير طبيعية ، على سبيل المثال تعكس مراحل ما بعد الزرع10. يمكن للجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين المجموعات أن توفر معلومات عن نظائرها في عملية التطوير من خلال تقييم مستويات التعبير عن مجموعات الجينات المرجعية التي تحدد الأنساب الخاصة بالمرحلة. وهذا يسمح بقياس إثراء المجموعات الفرعية للأروميات إما من خلال خرائط المسافة غير الخاضعة للإشراف (على سبيل المثال، باستخدام الجينات الغنية العليا) أو عن طريق تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA)43. باستخدام بروتوكول الأريمات هذا ، تتشكل ثلاث مجموعات رئيسية فقط تعكس نسخيا سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. تتضمن إحدى المجموعات كلا من hPSCs الساذجة الأولية والتناظرية epiblast للأروميات. أظهر تحليل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة الطبيعة المتسلسلة لمواصفات الأنساب (تبدأ الأرومات الغاذية في التحديد في غضون 24 ساعة ، وخلايا الأديم الباطن البدائية في غضون 60 ساعة). استوعب تجمع عالي الدقة مجموعة فرعية من الخلايا (3.2٪) تعبر عن جينات خاصة بأجنة مرحلة المعدة (ربما الأديم المتوسط أو السلى). تجدر الإشارة إلى أن hPSCs الساذجة الأولية شكلت أيضا 5٪ من الخلايا الشبيهة بمرحلة ما بعد الزرع ، كما هو موضح سابقا44. في تحليل ثان ، يمكن دمج الخلايا البلاستويدية في سيليكو مع الخلايا المرجعية المعزولة من concepti في مراحل مختلفة45،46،47 من أجل استنتاج تكافؤ المرحلة. هنا ، تم استخدام الخلايا المعزولة من مفهوم ما قبل الزرع 45,46 ، في المختبر الأريمية المستزرعة45 ، والأجنة في مرحلة المعدة47 كنقاط مرجعية. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحديد كمية أن الخلايا الأريمية غير المتطابقة التي كشفت عنها التجمعات عالية الدقة تتجمع بالفعل مع الأديم المتوسط والسلى بعد الزرع. في الخطوات المستقبلية ، يجب استكمال قياس النسخ بتحليل تعبير transposon ، ومثيلة الحمض النووي ، وحالة الكروموسوم X التي توفر أيضا معالم المراحل التنموية21.

تقييم تكوين المحور والوظائف الأخرى للأروميات البشرية. تتميز الكيسة الأريمية الناضجة بتكوين الأرومات الغاذية ذات المحور الجنيني غير الجنيني للزرع. باستخدام بروتوكول الأروميات هذا ، يتشكل محور بقوة يتمثل في نضج الأرومات الغاذية القريبة (على سبيل المثال ، NR2F2 + / CDX2-) التي تكتسب القدرة على الالتصاق بالخلايا العضوية لبطانة الرحم فقط عندما يتم تحفيزها هرمونيا48,49. تظهر المقارنة مع الأكروسفير التي لا تشكل الأبلوبلاست أن هذه الخلايا الداخلية تحفز الأرومات الغاذية المتاخمة على النضج من أجل التوسط في الارتباط الأولي ببطانة الرحم. عند استزراعها في وسط استزراع ممتد مصمم للكيسات الأريمية للقرد cynomolgus50 ، فإن جميع السلالات الثلاثة من الأروميات تتوسع باستمرار لمدة ستة أيام إضافية (أي ما يعادل الوقت لليوم 13) على الرغم من أن تنظيمها لا يعكس تلك المرحلة التنموية.

الآثار المترتبة على الأروميات البشرية عالية الكفاءة وعالية الدقة. إن الحفاظ على المبادئ التنموية التي تم اكتشافها في الكائنات الحية النموذجية أمر صعب الاختبار بطبيعته في المفهوم البشري بسبب محدودية الوصول والصعوبات التقنية في التلاعب به وراثيا وجسديا. ومن شأن نموذج بلاستويد عالي الكفاءة وعالي الدقة أن يسمح بإجراء فحوصات جينية ودوائية عالية الإنتاجية، والتي هي أساس الاكتشافات العلمية والطبية الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدراج تعديلات وراثية معقدة لتغيير العمليات البيولوجية وتسجيلها من شأنه أن يكمل هذه الدراسات. بشكل عام ، نقترح أن يكون التثبيط الثلاثي (فرس النهر ، TGF-β ، ERK) ل PXGL hPSCs الساذج موصلا للتكوين الفعال للأروميات البشرية عالية الدقة التي تتوافق مع المعايير الأربعة الدنيا. إن الطبيعة القابلة للتطوير والمتعددة الاستخدامات لهذا البروتوكول تجعله مناسبا لإنشاء فرضيات مستهدفة يمكن بعد ذلك التحقق من صحتها باستخدام الكيسة الأريمية البشرية. على هذا النحو ، لن تحل الأروميات البشرية محل استخدام المفهوم البشري للبحث في المختبر ولكنها قد تعمل كوسيلة قوية لتوجيه البحث من خلال مناهج تجريبية لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا في قلب عملية الاكتشاف العلمي والطبي الحيوي. يوضح البروتوكول كيفية تكوين الأروميات البشرية وكذلك كيفية تحليل الخلايا الموجودة داخل البلاستويد.

Protocol

توصي المبادئ التوجيهية لأبحاث الخلايا الجذعية والترجمة السريرية للجمعية الدولية لأبحاث الخلايا الجذعية (ISSCR) بأن البحث عن الأروميات البشرية لا يسمح به إلا بعد المراجعة والموافقة من خلال عملية مراجعة علمية وأخلاقية متخصصة 3,4. تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية باتباع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة لمعهد التكنولوجيا الحيوية الجزيئية التابع للأكاديمية النمساوية للعلوم (IMBA) بموجب الموافقة Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. الامتثال لهذه المبادئ التوجيهية ضروري لنشر نتائج البحوث في المجلات العلمية.

1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية الساذجة البشرية في حالة PXGL

ملاحظة: يمكن الحصول على hPSCs الساذجة من المختبرات ذات الصلة. تم الحصول على الخطوط المستخدمة هنا من مختبرات ياسوهيرو تاكاشيما (حاليا في CiRA ، كيوتو ، اليابان) وأوستن سميث (حاليا في معهد النظم الحية ، إكستر ، المملكة المتحدة). بدلا من ذلك ، يمكن إعادة تعيين hPSCs الساذجة في المنزل من خطوط hPSCs الجاهزة كما هو موضح سابقا13,14. تبدو hPSCs الساذجة مستقرة لعدة مقاطع (> 15) ولكن يمكن أن تختلف جودة الثقافة بمرور الوقت. إذا انخفضت جودة hPSC الساذجة ، فقم بإذابة قارورة جديدة من الخلايا أو توليد hPSCs ساذجة من PSCs الجاهزة. للاطلاع على جميع تركيبات الوسائط، انظر الجدول التكميلي 1.

  1. تحضير طبقة التغذية الجنينية للفئران المشععة (MEFs)
    1. في اليوم السابق لمرور hPSCs الساذجة ، قم بإعداد صفيحة زراعة خلايا من 6 آبار مع طبقات MEF مشععة باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    2. قم بتغطية صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ب 1 مل من الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في PBS لكل بئر. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة محلول الجيلاتين.
    3. تحضير MEF المتوسطة في 37 درجة مئوية.
    4. قم بإذابة MEFs في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترك كتلة جليدية صغيرة فقط. قم بإذابة حجم القارورة مع 1 مل من وسط MEF المحضر باستخدام ماصة P1000.
    5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل. قم بتدوير التعليق عند 200 × g لمدة 4 دقائق. قم بشفط المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات MEF عن طريق إضافة وسط MEF طازج (يكفي ل 1.5 مل لكل بئر).
    6. عد الخلايا باستخدام شرائح عد الخلايا وأضف 300000 خلية لكل بئر وانقل اللوحة إلى حاضنة نورموكسي عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا انفصلت MEFs بمرور الوقت ، فيمكن إضافة MEFs جديدة إلى وسيط PXGL أثناء تغيير الوسائط الروتيني.
  2. تمرير الخلايا الجذعية البشرية الساذجة متعددة القدرات
    1. قبل تمرير hPSCs ، تحقق من مورفولوجيتها تحت المجهر. عادة ما يكون للمستعمرات مورفولوجيا على شكل قبة ذات حدود مشرقة ومحددة. إذا أظهرت المستعمرات الفردية مورفولوجيا أكثر تملقا أو إذا بدأت مستعمرات متباينة في الظهور ، فاتبع تعليمات الخطوة 1.2.8.
    2. شفط الوسط وغسل الخلايا مع PBS مرة واحدة. أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا لكل بئر من صفيحة 6 آبار.
    3. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدم ماصة P1000 وماصة الخلايا عدة مرات لفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة.
    4. جمع الخلايا ونقلها إلى أنبوب 15 مل يحتوي على مخزن مؤقت للغسيل (1 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار ). قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
    5. استنشق السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في وسط PXGL الطازج (يكفي ل 1.5 مل لكل بئر). ضع في اعتبارك نسبة تقسيم 1:3-1:6 للتمرير الروتيني.
      ملاحظة: بعد كل 3-4 ممرات أو إذا انخفضت جودة زراعة الخلايا بناء على مورفولوجيا الخلية (على سبيل المثال ، ظهور مستعمرات مسطحة في السكان) ، أضف 10 ميكرومتر Y-27632 ومستخلص الغشاء السفلي لعامل النمو (5 ميكرولتر / بئر) إلى الوسط خلال ال 24 ساعة الأولى بعد المرور.
    6. قبل إعادة طلاء hPSCs ، قم بإعداد الألواح باستخدام MEFs الطازجة عن طريق شفط وسط MEF وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. ثم ، استخدم ماصة P1000 لنقل 1.5 مل من تعليق خلية hPSCs لكل بئر من لوحة 6 آبار تحتوي على MEFs.
      ملاحظة: تأكد من أن السحب يؤدي إلى بذر متجانس للخلايا عبر منطقة البئر. هذا سيضمن نمو المستعمرات ذات الأحجام المتجانسة والتزامن النسبي للخلايا.
    7. استزراع hPSCs تحت ظروف نقص الأكسجة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة. بعد 24 ساعة ، يجب إرفاق hPSCs. يعكس عدد كبير من الخلايا غير الملتصقة (أو العائمة) مشكلة في الجدوى أو التعلق عند المرور.
    8. تغيير الوسط مع 1.5 مل من PXGL المتوسطة لكل بئر يوميا. مرور hPSCs كل 3-4 أيام أو استخدامها لتجارب تشكيل blastoid.
      ملاحظة: بعد إذابة hPSCs ، قم بمرورها لمدة لا تقل عن ثلاثة مقاطع قبل البدء في تجربة الأروميات.

2. تشكيل البلاستويدات

  1. تشكيل مجاميع PSC الساذجة
    1. قم بإعداد وسائط PXGL والوسائط القاعدية N2B27 وتسخينها مسبقا ومخزن الغسيل المؤقت وPBS ووسائط التجميع قبل بدء التجربة. استبعاد MEFs من تعليق hPSCs لتشكيل الأروميات باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    2. لاستبعاد MEF ، قم بإعداد صفيحة مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة 1 مل من الجيلاتين بنسبة 0.1٪ إلى بئر صفيحة من 6 آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30-90 دقيقة.
    3. لحصاد الخلايا ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا ب 1 مل من PBS.
    4. أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا (لكل بئر من صفيحة 6 آبار) واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. تحقق من الخلايا تحت المجهر لمتابعة تفكك المستعمرات إلى خلايا مفردة (يمكن فصل عدد قليل من الكتل متعددة الخلايا لاحقا عن طريق السحب اللطيف).
    6. تمييع محلول انفصال الخلايا مع 1 مل من الغسيل العازل. جمع الخلايا من اللوحة عن طريق سحب بلطف 5 إلى 10 مرات. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
    7. شفط supernatant ، وإعادة تعليق الخلايا في 1.5 مل من وسط PXGL (لكل بئر من صفيحة 6 آبار) وزرع الخلايا على لوحات المغلفة بالجيلاتين لاستبعاد MEF وحضانتها عند 37 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة.
    8. بمجرد أن يتم زرع الخلايا الساذجة لاستبعاد MEF ، قم بإزالة PBS من microwells وقم بموازنة الآبار مع 200 ميكرولتر من وسط N2B27 القاعدي (لكل شريحة ميكروويل 1) واحتضنها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    9. جمع supernatant التي تحتوي على الخلايا الساذجة غير المرفقة ، ونقلها إلى أنبوب 15 مل ، وتدور الخلايا في 200 × غرام لمدة 4 دقائق.
    10. شفط الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من الوسائط القاعدية N2B27. عد الخلايا باستخدام شرائح عد الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
    11. قم بشفط الوسط وإضافة كمية مناسبة من 10 ميكرومتر Y-27632 الموجودة في وسائط N2B27 للحصول على كثافة خلية تبلغ 30000 خلية لكل 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف رقم خلية البذر الأولي الأمثل بين خطوط الخلايا المختلفة. على سبيل المثال ، لزرع 50-60 خلية / ميكروويل ، يتم زرع 30000 خلية (بما في ذلك الفائض بالنظر إلى أن بعض الخلايا تقع خارج البئر الدقيقة) في بئر واحد من 96 صفيحة بئر تحتوي على 430 بئر صغير. يمكن أن يؤدي رقم خلية البدء غير المناسب إلى تكوين الركام الصغير دون تجويف أو تكوين بنية مجوفة تصل إلى أكثر من 250 ميكرومتر.
    12. استنشق الوسط من صفائف microwell المتوازنة وأضف 25 ميكرولتر من وسائط N2B27 مع 10 ميكرومتر Y-27632. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (حتى تسقط الخلايا في قاع البئر الصغير). ثم ، أضف 125 ميكرولتر من وسط N2B27 مع استكمال 10 ميكرومتر Y-27632.
  2. تطور البلاستويد
    1. في غضون 24 ساعة ، يمكن ملاحظة مجاميع من hPSCs الساذجة (اليوم 0) على رقاقة microwell. لبدء تكوين الأروميات ، قم بإعداد وسط PALLY واتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    2. يسخن PALLY مسبقا في الوسط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إضافة 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) و 10 μM Y-27632 قبل الاستخدام مباشرة. يتراوح التركيز الأمثل ل LPA بين 0.5-5 ميكرومتر. يجب معايرة هذا لخطوط hPSC الفردية المستخدمة في الأرومات.
    3. شفط وسيط التجميع. أضف 200 ميكرولتر من وسط PALLY المسخن مسبقا إلى الآبار الدقيقة. ضع صفيحة زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة نقص الأكسجة عند 37 درجة مئوية. كرر تغيير الوسائط في اليوم 1.
    4. في اليوم 2 ، قم بإزالة وسط PALLY وإضافة 200 ميكرولتر من وسط N2B27 المكمل ب LPA و 10 ميكرومتر Y-27632.
      ملاحظة: في اليوم 2 تستمر غالبية المجاميع في النمو. ومع ذلك ، فإن بعض المجاميع تشكل تجاويف صغيرة. استزراع الأروميات باستمرار في PALLY حتى اليوم 4 أو في وسط الثقافة المخبرية (IVC1) من اليوم 2 فصاعدا. ومع ذلك ، فإن اتباع هذا التغيير في الوسائط يعزز تكوين PrE في الأروميات الناضجة.
    5. كرر تغيير الوسائط في اليوم 3. يحدث تكوين الأرومي الكامل بحلول اليوم 4.
      ملاحظة: تعتبر الأروميات قد تطورت بشكل كامل عندما خضعت لتكوين مورفوجيني كامل استنادا إلى المورفومترات المورفومترية للكيسات الأريمية البشرية في اليوم 7 (على سبيل المثال ، يتراوح قطرها من 150 إلى 250 ميكرومتر ؛ مجموعة داخلية واحدة محاطة بظهارة من الخلايا الشبيهة بالأديم التغمعين) وشكلت خلايا تشبه الأديم التغذي القطبي (NR2F2 + / CDX2-) وخلايا تشبه PrE (GATA4 +). يمكن تقييم ذلك باستخدام تلطيخ التألق المناعي أو فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS).

3. تشكيل الأروميات في 96 بئر منخفضة للغاية التعلق microplates

  1. قم بإعداد تعليق خلية hPSCs ساذج لتشكيل الأروميات باتباع الخطوات الموضحة أعلاه من 2.1.1 - 2.1.11.
  2. قم بشفط الوسط وإضافة كمية مناسبة من وسائط N2B27 التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 للحصول على كثافة الخلية من 70 خلية لكل 100 ميكرولتر من الوسط.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف رقم خلية البذر الأولي الأمثل بين خطوط الخلايا المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون 70 خلية / بئر هي رقم الخلية الأمثل لمعظم خطوط الخلايا.
  3. جهاز الطرد المركزي للصفيحة عند 200 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لتجميع الخلايا في قاع الآبار.
  4. احتضن اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثقافة نقص الأكسجين. في غضون 24 ساعة يمكن ملاحظة مجاميع من hPSCs الساذجة (اليوم 0) على الآبار.
  5. تحضير 2x PALLY المتوسطة. أضف 100 ميكرولتر من متوسط 2x PALLY المسخن مسبقا إلى الآبار.
  6. ضع صفيحة زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة نقص الأكسجة عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، استنشق نصف الوسائط (100 ميكرولتر) واستبدلها ب 100 ميكرولتر من وسط PALLY المسخن مسبقا. كرر الخطوة حتى اليوم 4. تأكد من عدم استنشاق المجاميع.
    ملاحظة: في اليوم 2 ، تستمر غالبية المجاميع في النمو. ومع ذلك ، فإن بعض المجاميع لها تجاويف صغيرة مملوءة بالسوائل. في اليوم 4 ، تخضع غالبية الهياكل المجوفة لتكوين مورفوجيني كامل لتشكيل هياكل تشبه الكيسة الأريمية.

4. تشكيل الأغلفة

  1. بالنسبة لتكوين الغلاف التغذي ، اتبع بروتوكول تكوين الأروميات من الخطوة 2.1.1 (استبعاد MEF) حتى الخطوة 2.1.12 (الخطوة الأخيرة من بروتوكول البذر).
  2. بمجرد أن تتشكل مجاميع من hPSCs الساذجة بعد 24 ساعة ، استبدل وسط التجميع مع PALY (بدون LIF) المكمل ب 3 ميكرومتر SC-144 لتشكيل الغلاف الغذائي الذي يمثل الأديم التغذي المبكر و PALLY المكمل ب 2 ميكرومتر XMU-MP-1 لتشكيل الغلاف التغذي الذي يمثل الأديم التغذي الناضج.
  3. قم بتحديث الوسط يوميا. يحدث تكوين الغلاف الغاذي الكامل بحلول اليوم 4.

5. تحليل حالة الخلايا الأريمية ومرحلتها المنعكسة باستخدام scRNAseq

  1. لالتقاط الأروميات وإجراء التفكك ، قم بتسخين حاضنة الاهتزاز إلى 37 درجة مئوية واضبطها على 100 دورة في الدقيقة.
  2. جمع الأروميات من لوحة 96 بئر الأولية ونقلها إلى آبار متعددة من لوحة U-bottom 96 بئر باستخدام ماصة الفم مجهزة بشعيرات شعرية زجاجية.
    ملاحظة: يجب اختيار الأروميات (> 70٪) بناء على المعايير المورفومترية (الحجم = 150-250 ميكرومتر مع مجموعة داخلية فريدة) من أجل تجنب التلوث بالهياكل غير الأرومية (< 30٪).
  3. اغسل مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من PBS باستخدام P200 عن طريق العرض تحت المجهر المجسم. ينقل إلى بئر يحتوي على 50 ميكرولتر من الكولاجيناز ويحضن لمدة 30 دقيقة في حاضنة الاهتزاز.
  4. انقل الأروميات إلى بئر مع 100 ميكرولتر من 10x trypsin-EDTA واخلطها جيدا. احتضان لمدة 20 دقيقة في حاضنة الاهتزاز.
  5. قم بفصل الأروميات إلى خلية واحدة باستخدام ماصة P200. انقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل مع مخزن مؤقت FACS (1٪ FBS في PBS).
  6. لالتقاط نسب محددة من نظائرها من السلالات الثلاثة ، قم بتلطيخ نظائر TE و PrE بالأجسام المضادة TROP2 و PDGFRa على التوالي.
    ملاحظة: عدد خلايا PrE في الكيسة الأريمية البشرية أقل مقارنة بالكيسات الأريمية للفئران، والتي قد تعكس العيوب التنموية للكيسات الأريمية التي تشكلت من خلال الإخصاب في المختبر (IVF) أو اختلاف الأنواع. في الأروميات ، تكون نظائر PrE أقل وفرة من نظائر TE و EPI وتمثل 7.4٪ من الخلايا عند حساب خلايا GATA4 + عن طريق التصوير المناعي الفلوري. أيضا ، قد تحفز عملية التفكك تحيزات في نسب أنواع الخلايا المختلفة كنظائر PrE لتمثيل 1٪ -2٪ من الخلايا عند تفكك الأرومة ، ووضع علامات PDGFRa وتحليل FACS.
  7. خلايا فرز FACS-من جميع نظائر السلالات الثلاثة إلى 384 لوحة تحتوي على مخزن مؤقت للتحلل لتحليل smart-seq2. استبعاد الخلايا الميتة التي تتميز بتلطيخ DAPI (يتم تنفيذها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).
  8. لتقييم حالات الخلية (نوع الخلية ومرحلة النمو) ، قارن البيانات النسخية من blastoid مع عناصر التحكم المناسبة.

6. ثقافة موسعة لتقييم التقدم التنموي البلاستويدي

  1. استزرع الأروميات البشرية على ألواح مصفوفة الغشاء السفلي (القاع الزجاجي).
    1. قم بتغطية اللوحة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي.
    2. فحص بصريا للأروميات لتقييم وتسجيل المورفولوجيا.
      ملاحظة: فقط الأروميات التي تعرض مورفولوجيا الكيسة الأريمية الكلاسيكية ذات الكرة المجوفة مع ICM المدمجة لديها القدرة على النمو والتطور أكثر.
    3. أضف 100 ميكرولتر من CMRL medium-1 لكل بئر واحد من لوحة 96 بئرا ، وضع اللوحة في الحاضنة قبل 2 ساعة على الأقل من نقل الأروميات لتحقيق التوازن.
    4. باستخدام المجهر المجسم، حدد بصريا الأروميات ذات المورفولوجيا الجيدة، وانقل الأروميات المختارة في بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من CMRL medium-1 لإزالة آثار وسائط البلاستويد.
    5. انقل الأروميات إلى البئر التي تحتوي على وسائط CMRL المتوازنة مسبقا-1. ضع الطبق في الحاضنة واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يمكن استزراع ما يصل إلى 5 بلاستونويدات في بئر واحد من 96 لوحة بئر. وجود الكثير من الأروميات في بئر واحد قد يؤدي إلى تشكيل مجاميع من الأروميات المتعددة.
    6. في اليوم التالي ، افحص بصريا الأروميات تحت المجهر. إذا تم إرفاق الأروميات ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط CMRL المتوازنة مسبقا -1 مع استكمال مصفوفة الغشاء السفلي بنسبة 5٪. ضع اللوحة في الحاضنة واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    7. في اليوم التالي ، راقب الأروميات تحت المجهر. قم بإزالة نصف الوسائط (100 ميكرولتر) واستبدلها ب 100 ميكرولتر من وسائط CMRL المتوازنة مسبقا -2 المكملة بمصفوفة غشاء سفلي بنسبة 5٪.
    8. في الأيام التالية ، استبدل نصف الوسائط (100 ميكرولتر) بوسائط CMRL 3 المتوازنة مسبقا والمكملة بمصفوفة غشاء سفلي بنسبة 5٪. ضع اللوحة في الحاضنة واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. كرر كل يوم لمدة تصل إلى 4-6 أيام من الثقافة في المختبر .
      ملاحظة: لقد زرعنا الأروميات لمدة تصل إلى 6 أيام في ظروف الثقافة الممتدة التي تتوافق مع الوقت المكافئ لليوم 13 من الأجنة البشرية المستزرعة في المختبر .

7. الأرومات المناعية

  1. شفط الوسيط. اغسل العينات 3x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 200 ميكرولتر من بارافورمالديهايد البارد بنسبة 4٪ (PFA) في PBS وقم بإصلاح العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول PFA واغسل العينات 3x باستخدام PBS لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إذا تم استزراع الأروميات على رقائق microwell ، فقم بنقل الأروميات من الشريحة إلى لوحات U-bottom ذات 96 بئرا للخطوات التالية.
  3. تخلل وتمنع الأروميات في 100 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر (PBS يحتوي على 0.3٪ Triton-X 100 و 10٪ مصل الحمير العادي) لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على الأنواع المضيفة للأجسام المضادة ، قم بتكييف المصل وفقا لذلك.
  4. قم بإزالة حل الحظر. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول حجب جديد واحتضن العينات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب تحديد تركيزات الأجسام المضادة الأولية بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
  5. اغسل العينات 3x بنسبة 0.1٪ Triton-X 100 في PBS (محلول الغسيل) لمدة 10 دقائق. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب مع 20 ميكروغرام / مل من صبغة هويشت النووية واحتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء.
    ملاحظة: يجب تحديد تركيزات الأجسام المضادة الثانوية بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
  6. اغسل العينات 3x بمحلول غسيل لمدة 10 دقائق. للتصوير ، انقل العينات إلى الجزء السفلي الزجاجي μ الشريحة في PBS.
    ملاحظة: يجب تحديد وسيط التركيب بناء على الهدف المستخدم للتصوير. على سبيل المثال ، يمكن استخدام 80٪ من الجلسرين في PBS لتركيب العينات أثناء استخدام أهداف النفط.

Representative Results

عادة ما تكون hPSCs الساذجة المستزرعة في PXGL (الشكل 2A) عبارة عن هياكل مجمعة ومجوفة تظهر بين 48 إلى 72 ساعة بعد تحريض PALLY ويصل قطرها إلى 150-250 ميكرومتر في غضون 96 ساعة (الشكل 2B). باستخدام (1) أرقام خلايا البذر المثلى ، (2) مدة تجميع ما قبل الاستزراع مع N2B27 (0 إلى 24 ساعة) ، (3) تركيز المكونات الكيميائية الفردية (خاصة LPA) ، و (4) مدة معالجة PALLY ، تصل كفاءة الحث إلى 70٪ -80٪ كما هو محدد بناء على المعلمات المورفومترية (الحجم الإجمالي 150-250 ميكرومتر ، تجويف منتظم واحد ، مجموعة خلية داخلية واحدة ؛ الشكل 2C ، D) ووجود الأنساب الثلاثة. ستؤدي حالة الخلية الأولية دون المستوى الأمثل و / أو ظروف الحث إلى تكوين أرومي أقل كفاءة أو معدومة. لضمان أقصى قدر من الكفاءة وتشكيل نظائر ما قبل الزرع فقط ، من الأهمية بمكان استخدام ثقافة عالية الجودة من PXGL hPSCs الساذجة. يمكن تقييم ذلك عن طريق قياس النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للعلامات السطحية SUSD2 (الحالة الساذجة) و CD24 (الحالة الجاهزة) بواسطة FACS. ستكون العلامات السطحية الإضافية الخاصة بالسلالات خارج الجنين خارج الهدف (على سبيل المثال ، السلى ، الأديم المتوسط خارج الجنين) مفيدة أيضا ، ولكن ، على حد علمنا ، غير متوفرة حاليا. إذا كانت كفاءة التكوين التي تم الحصول عليها أقل من النتائج المبلغ عنها ، فمن المهم التحقق بعناية من جميع مكونات الوسط الأرومي ، وخاصة LPA التي يتم إعادة تشكيلها في PBS والتي ، كرابطة GPCR ، يمكن أن تكون أكثر استقرارا مقارنة بالجزيئات الاصطناعية المعاد تشكيلها في DMSO. في معظم الحالات ، حتى لو لم يكن العائد هو الحد الأقصى ، فإن الهياكل المجوفة لا تزال تتكون من سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. يمكن تأكيد ظهور ثلاثة سلالات من الكيسة الأريمية وتشكيل محور جنيني غير جنيني من خلال تلطيخ العلامات المناعي (EPI: NANOG ، OCT4 ، TE: GATA3 ، Polar-TE NR2F2 ، Mural-TE: CDX2 ، PrE: GATA4 ؛ الشكل 2 هاء، زاي). يساعد التروفوسفير ، الذي يتكون فقط من TE ، على زيادة تشريح دور الاتصال بين الخلايا. يمكن أن تتشكل التروفوسفير بكفاءة 50٪ -60٪ في غضون 96 ساعة من الحث (الشكل 2H ، I). يمكن إجراء تكوين الأروميات ليس فقط في صفائف microwell محلية الصنع ولكن أيضا في لوحات البئر 96 ذات التعلق المنخفض للغاية المتاحة تجاريا مع تحسين ظروف الحث (انظر البروتوكول والشكل 2J). كما أن الأروميات لديها القدرة على مواصلة التطور لمدة 6 أيام إضافية ، وهو ما يعادل الوقت لجنين اليوم 13 ، مع بروتوكول التمايز في المختبر (الشكل 2K).

من أجل زيادة توصيف حالة خلية الخلايا الأريمية ، يجب استخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. يتم تطبيق UMAP بشكل شائع لتصور توزيع حالات الخلايا ويتم إجراء تحليل تجميع غير خاضع للإشراف عليه لتقييم قرب حالات الخلايا الفردية. يمكن أن تؤثر المعلمات المختلفة في تحليل بيانات الخلية الواحدة على كيفية عرض الخلايا في UMAPs ، مما يؤدي إلى مجموعات ذات مواقع وأشكال مكانية ونسبية مختلفة (الشكل 3A). ومع ذلك ، في هذا التحليل ، تعرض الخلايا ملفات تعريف تجميع متميزة بشكل ملحوظ بغض النظر عن المعلمات المستخدمة لإجراء التجميع وتصور البيانات ، مما يسمح بالتمييز بثقة عالية بين سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. استخدمنا خلايا من الأجنة التي تم حصادها في مراحل نمو مختلفة كمرجع. ويبين دمج مجموعات البيانات هذه أن غالبية الأديم التناظري للغضروف من الأروميات تتجمع مع الأديم التغذي قبل الزرع ولكن ليس مع الأرومات الغاذية بعد الزرع (الشكل 3 ب). تم تأكيد هذه النتائج أيضا من قبل كونسورتيوم مستقل10.

عندما يتم إدخال أجنة كارنيغي في المرحلة 7 (CS7) في الخريطة المرجعية، تتجمع مجموعة صغيرة من الخلايا الأريمية (3٪) مع سلالات الأديم المتوسط والسلى لهذه الأجنة (الشكل 3C). عندما يتم إدخال خلايا تشبه السلى في الخريطة المرجعية ، تتجمع مجموعة صغيرة من الخلايا البلاستويدية (< 2٪) مع هذه الخلايا الشبيهة بالسلى.

بشكل عام ، فقط الهياكل التي تتكون من تجويف منتظم واحد ، ومجموعة خلية داخلية واحدة ، وحجم إجمالي يتراوح بين 150-250 ميكرومتر ، تضم نظائر نسخية لسلالات الكيسة الأريمية الثلاثة ، وخالية إلى حد كبير من سلالات أخرى (على سبيل المثال ، السلى ، الأديم المتوسط ، الأديم المتوسط خارج الجنين) تعتبر أروميات بشرية.

Figure 1
الشكل 1: أربع ميزات ونهجان لتوليد الأروميات عالية الدقة.

Figure 2
الشكل 2: الأروميات والغلاف الغذائي المشتقة من مجاميع hPSC الساذجة. (أ) صور تباين الطور التي تظهر مركبات hPSC ساذجة مستزرعة في وسط PXGL مستزرعة بشكل مشترك مع MEF المشععة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (B) صور تباين الطور التي تظهر التغير المورفولوجي لمجاميع hPSCs الساذجة المستزرعة على صفيف ميكروويل هيدروجيل غير ملتصق مع 500 نانومتر LPA (وسط بالي). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (C) الأروميات البشرية التي تشكلت على صفيف ميكروويل بعد 96 ساعة. قضبان المقياس: 400 ميكرومتر (D) تقدير كمي للنسبة المئوية للآبار الدقيقة التي تحتوي على بلاستويد بشري ناجم عن حالة زراعة PALLY مع تركيز LPA محسن من خطوط hPSC ساذجة مختلفة (n = 3 صفائف microwell). (ه) تلطيخ الأروميات البشرية بالتألق المناعي بعلامات إببلاست (EPI) (صفراء) NANOG و OCT4؛ علامات TE (سماوية) CDX2 و GATA3 ؛ وعلامة الأديم الباطن البدائية (أرجواني) SOX17 و GATA4. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (H-I) تحديد كمية عدد الخلايا (يسار) والنسبة المئوية للخلايا (يمين) التي تنتمي إلى كل سلالة في blastoid (96 h) بناء على تلطيخ التألق المناعي ل OCT4 و GATA3 و GATA4. (ز) تلطيخ التألق المناعي للأروميات البشرية ل CDX2 (سماوي) و NR2F2 (أرجواني). (و) صور تباين الطور للغلاف التغروي في المراحل المبكرة والمتأخرة على صفيف ميكروويل الناجم عن إضافة 3 ميكرومتر SC144 (H) أو 2 ميكرومتر XMU-MP-1 (I)، على التوالي. (ي) صور تباين الطور التي تبين التغير المورفولوجي لمجاميع hPSCs الساذجة المستزرعة في صفيحة بئر 96 ذات التعلق المنخفض للغاية مع 500 نانومتر LPA (وسط بالي). (K) صورة تباين الطور (يسار) وتلطيخ التألق المناعي (يمين) ل OCT4 (أصفر) ، GATA3 (سماوي) ، و GATA4 (أرجواني) في البلاستويد المزروع في حالة ثقافة ما بعد الزرع لمدة 6 أيام. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. هذا الرقم مقتبس من 6,10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف تكوين الأروميات عن طريق تسلسل خلية واحدة. (أ) تحليل التجميع غير الخاضع للإشراف مع معلمات مختلفة على UMAP لنسخ الخلايا المفردة المشتقة من النقاط الزمنية المختلفة للأروميات (24 ساعة ، 60 ساعة ، 96 ساعة) ، hPSCs الساذجة ، hPSCs الجاهزة ، و hTSC (تمثل الأرومة الضاغطة الخلوية بعد الزرع). (ب) UMAP لنسخ الخلايا المشتقة من الأروميات (96 ساعة) ، hPSCs الساذجة ، و hPSCs الجاهزة المدمجة مع مجموعات البيانات المنشورة من الأجنة البشرية قبل الزرع ، وشبه الزرع (الكيسات الأريمية المستزرعة في المختبر ) ، والمعدة (مرحلة كارنيغي 7 ، أي بين E16-19) مراحل. يتم تلوين الخلايا الفردية بناء على أصلها في الأجنة البشرية (يسار) ، والخلايا المشتقة من الأروميات أو الخلايا الجذعية (الوسط) ، ونتيجة لتحليل التجميع غير الخاضع للإشراف (يمين). (ج) UMAPs لنسخ الخلايا المشتقة من الأروميات ، hPSCs الساذجة ، hPSCs الجاهزة ، والمتكاملة مع مجموعة البيانات المنشورة من مرحلة المعدة (مرحلة كارنيجي 7 ، أي بين E16-19) مرحلة الجنين. يتم تلوين الخلايا الفردية بناء على أصلها في الأجنة البشرية (يسار) ، والخلايا المشتقة من الأروميات أو الخلايا الجذعية (الوسط) ، ونتيجة لتحليل التجميع غير الخاضع للإشراف (يمين). هذا الرقم مقتبس من6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: جميع التركيبات الإعلامية المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

في هذه الدراسة ، نعرض ، خطوة بخطوة ، كيفية إنشاء الأروميات البشرية ذات الكفاءة العالية باستخدام بروتوكول بسيط وقوي. عند تجميع HPSCs الساذجة PXGL وتثبيطها الثلاثي ، تتشكل الأروميات بكفاءة (> 70٪) وتولد بالتتابع نظائر الكيسة الأريمية 3 في غضون 4 أيام. يمكن أن تحدث قيود في كفاءة وجودة الأروميات (على سبيل المثال ، وجود خلايا خارج الهدف) إذا كانت الحالة الأولية دون المستوى الأمثل. تجدر الإشارة إلى أننا قمنا بقياس أن PXGL hPSCs يحتوي على حوالي 5٪ من الخلايا التي تعكس مراحل ما بعد الزرع. قد تحد هذه الخلايا من تكوين الأروميات عالية الجودة. بالإضافة إلى حالة PXGL الساذجة الأولية التي تعكس البلاستيدات الكيسية الأريمية ، هناك عامل محوري آخر هو الوسط المستخدم لتشكيل الأروميات. من أجل تشكيل خلايا تشبه الكيسة الأريمية بسرعة ومنع تكوين خلايا شبيهة بالخلايا غير المستهدفة ، بعد الزرع ، نقترح أن تثبيط المسارات الثلاثية (فرس النهر ، ERK ، TGF-β) أمر ضروري. في حين أن خطوط الخلايا المختلفة تعطي غلات مختلفة من الأروميات على تثبيط ERK / TGF-β (عموما حوالي 10٪ -20٪) ، فإن التعرض ل LPA يؤدي إلى تكوين عائد أرومي مرتفع بنفس القدر عبر جميع خطوط الخلايا ، مع استخدام معايير صارمة لمواصفات المورفومترية والنسب. ربما يعمل LPA على تثبيط مسار فرس النهر ، الذي يلعب دورا حاسما في الفصل الأول بين السلالات الأبلاستية و trophectoderm في الفأر والإنسان 8,51. يشير التحسن الكبير في كفاءة الأريمية بواسطة LPA إلى أن آليات مواصفات الخلية الداخلية والخارجية بوساطة مسار فرس النهر في اللعب في الكيسة الأريمية يتم اختيارها أثناء تكوين الأريمية. يكمن أحد القيود الحالية في حقيقة أنه نظرا لوجود ما دون المستوى الأمثل للبروتوكولات المستخدمة لزراعة الكيسة الأريمية البشرية أو الأروميات في اليوم المكافئ للوقت 7-13 (بعد تكوين الكيسة الأريمية / الأريمية) ، فإننا لسنا قادرين على تقييم إلى أي مدى يمكننا نمذجة تطور ما بعد الزرع بشكل صحيح.

يمكن بسهولة تحقيق تحليل الحالة النسخية للخلايا الأريمية باستخدام scRNAseq والخرائط المرجعية الكافية وطرق المعلوماتية الحيوية. في السابق ، أظهر التحليل النسخي أن hPSCs المستزرعة في PXGL هي أكثر تشابها مع ابيبلاست الكيسة الأريمية مقارنة بالحالة الجاهزة. يمكن أن تحدث قيود في تحليل البيانات إذا كانت الخريطة المرجعية تضم فقط خلايا مرحلة الكيسة الأريمية. يجب أن تتضمن الخريطة المرجعية الخلايا الناشئة عن أجنة ما بعد الزرع من أجل تقييم وجود خلايا محتملة خارج الهدف. في المستقبل ، من أجل قياس الخلايا الأريمية ، ستكون الخريطة المرجعية التي تشمل جميع أنسجة المفهوم البشري قبل وبعد الزرع قيمة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخرائط المرجعية متعددة الخلايا الواحدة، بما في ذلك النسخ على سبيل المثال، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، ومثيلة الحمض النووي، من شأنها أن تساعد بشكل أكبر. وأخيرا، فإن الأساليب المعلوماتية الحيوية الموحدة لتقييم أوجه التشابه بين الخلايا من نماذج الأجنة والمفاهيم المرجعية بشكل كمي، وتحديد الخلايا غير المستهدفة بشكل إيجابي من شأنها أن تساعد بشكل أكبر على تحليل النتائج ومقارنتها بشكل غير متحيز.

إجمالا، تمتلك الأروميات التي تشكلت عن طريق التثبيط الثلاثي لمسارات فرس النهر و TGF-β و ERK السمات الأربع ل 1) التشكل عالي الكفاءة ، 2) التسلسل الصحيح لمواصفات النسب ، 3) النقاء العالي للخلايا الشبيهة بالكيسة الأريمية على مستوى النسخ ، 4) القدرة على نمذجة تطور ما حول الزرع. هذه الميزات من الأروميات سوف تسهل بناء فرضيات على تطور الكيسة الأريمية وزرعها ، ومع ذلك ، فإنها لا تلخص المراحل المبكرة من التطور الجنيني. وعلى النقيض من محدودية إمكانية الوصول إلى الكيسة الأريمية البشرية وتنوعها، فإن الكيسة الأريمية قابلة للفحص الجيني والدوائي للتحقيقات الوظيفية لتطور الكيسة الأريمية وزرعها. وفي المستقبل، يمكن أن تسهم هذه المعرفة الأساسية في تحسين صياغة وسائط التلقيح الاصطناعي، وتطوير وسائل منع الحمل بعد الإخصاب، وتحسين إدارة الحمل المبكر.

Disclosures

قدم معهد التكنولوجيا الحيوية الجزيئية التابع للأكاديمية النمساوية للعلوم طلب براءة اختراع EP21151455.9 يصف بروتوكولات تكوين الأروميات البشرية وفحص التفاعل بين الأرومة وبطانة الرحم. HK و AJ و HHK و NR هم مخترعو هذه البراءة. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية منحة ERC-Co رقم 101002317 "BLASTOID: منصة اكتشاف للتكوين الجنيني البشري المبكر"). يتم دعم H.H.K. من قبل صندوق العلوم النمساوي (FWF) ، برنامج ليز مايتنر M3131-B. نشكر ياسوهيرو تاكاشيما على مشاركة خطوط الخلايا H9 و H9-GFP ، وأوستن سميث وبيتر أندروز وجي قوه لمشاركة خطوط الخلايا HNES1 و Shef6 و niPSC 16.2b و cR-NCRM2. نشكر حسين باهارفاند على مشاركة عضويات بطانة الرحم. نشكر جوشوا م. بريكمان على مشاركة الحمض النووي الريبي المعزول من الخلايا المتمايزة PrE وخلايا nEND. نشكر شانكار سرينيفاس على مشاركة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لجنين ما حول المعدة. نشكر ألكساندر بيكوف ولويزا كوشيلا على المساعدة التقنية لإعداد مكتبة SMARTSeq2. نشكر مرفق NGS و Biooptic و Stem Cell في IMBA على المساعدة الحاسمة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal media in house
DMEM/F12 in house
100X N2 supplemen Gibco 17502048
50X B27 supplement Gibco 17504044
100X Glutamax Gibco 35050038
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360039
MEM-Non-essential amino acids Gibco 11140050
1 M Hepes in house
50 mM 2-Mercaptoethanol Thermofisher 31350010
100X Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A7979
PD0325901 Medchem express HY-10254
XAV-939 Medchem express HY-15147
Gö 6983 Medchem express HY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor in house
A83-01 Medchem express HY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) Peprotech 2256236
Y-27632 Medchem express HY-10583
CMRL medium Gibco 21530027
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10-828-028
Accutase Biozym B423201 cell detachment solution
Geltrex Thermofisher A1413302 growth factor basement membrane extract
TROP2 antibody R&D systems MAB650
PDGFRα antibody R&D systems AF307
SC-144 Axon 2324
XMU-MP-1 Med Chem Express HY-100526
Matrigel basement membrane matrix
Countess cell counting chamber slides Thermo fisher cell counting slides
DAPI Staining Solution Miltenyi Biotec 130-111-570

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
  2. Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
  3. Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
  4. Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
  5. Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
  6. Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
  7. Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
  8. Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
  9. Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
  10. Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
  11. Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
  12. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  13. Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), Cambridge, England. 2748-2763 (2017).
  14. Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
  15. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
  16. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  17. Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
  18. Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
  19. Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
  20. Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
  21. Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  22. Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
  23. Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
  24. De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
  25. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
  26. Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
  27. Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
  28. Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
  29. Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
  30. Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
  31. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  32. Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
  33. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  34. Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
  35. Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
  36. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  37. Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
  38. Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
  39. Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
  40. Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
  41. Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
  42. Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
  43. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  44. Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
  45. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  46. Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
  47. Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
  48. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  49. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
  50. Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
  51. Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 186 ،
بروتوكول نمذجة الأروميات البشرية تطوير وزرع الكيسة الأريمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kagawa, H., Javali, A., Heidari… More

Kagawa, H., Javali, A., Heidari Khoei, H., Sommer, T. M., Sestini, G., Novatchkova, M., Scholte op Reimer, Y., Rivron, N. Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation. J. Vis. Exp. (186), e63388, doi:10.3791/63388 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter