Mevcut protokolde, glikojenin zincir uzunluğu dağılımını (CLD) ve ortalama zincir uzunluğunu (ACL) belirlemek için Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) tekniği kullanılmaktadır.
Glikojen parçacıkları, α-1,4 glukozit bağları ile bağlanmış glukozil birimlerin doğrusal zincirlerinden oluşan dallanmış polisakkaritlerdir. İkincisi, dallanma noktaları olarak adlandırılan α-1,6 glukozit bağlantıları ile birbirine bağlanır. Farklı karbon depolama biçimleri arasında (yani, nişasta, β-glukan), glikojen muhtemelen canlı dünyada bulunan en eski ve en başarılı depolama polisakkaritlerinden biridir. Glukan zincirleri, gerektiğinde büyük miktarda glikozun bir hücrede hızlı bir şekilde depolanabilmesi veya yakıt doldurulabilmesi için düzenlenir. Glikojen parçacıklarının ince yapısını çözmek için son yıllarda çok sayıda tamamlayıcı teknik geliştirilmiştir. Bu makalede Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir glikojen parçacığı oluşturan glukan zincirlerinin popülasyonunu ölçer. Zincir uzunluğu dağılımı (CLD) olarak da bilinen bu parametre, parçacık boyutunu ve dallanma yüzdesini yansıtır. Aynı zamanda glikojen biyosentezinin matematiksel modellemesi için de önemli bir gerekliliktir.
Karbon ve enerji deposu olarak kullanılan glikojen, (1 → 4)-α bağları ile bağlanmış ve (1 → 6)-α glikosidik bağlar veya dallanma noktaları ile bağlanmış glukozil birimlerin doğrusal zincirlerinden oluşan bir glikoz homopolimeridir. Çok çeşitli organizmaların sitozolünde β ve α parçacıkları olarak görünürler. β parçacıkları, esas olarak prokaryotlarda gözlenen suda çözünür küçük parçacıklardır. Çapları 20-40 nm arasında değişir, muhtemelen glikojen metabolize edici enzimler ve sterik engel 1,2 tarafından belirlenir.
İlk olarak hayvan hücrelerinde tanımlanan daha büyük α parçacıkları, karnabahar benzeri bir şekle sahip 300 nm çapa kadar gösterir. Bu özel organizasyon, birkaç β parçacığın toplanmasından kaynaklanabilir veya tek bir β-parçacık3’ten tomurcuklanarak ortaya çıkabilir. İlginç bir şekilde, yakın tarihli bir çalışma, Escherichia coli4’te α parçacıklarının varlığını bildirmiştir. Bununla birlikte, hayvan hücrelerinden α parçacıkların aksine, ikincisi ekstraksiyon işlemi sırasında hızla parçalanır ve bu da literatürdeki veri eksikliğini açıklayabilir4. Ökaryotlarda ve prokaryotlarda α parçacıklarının ortaya çıkması, filogenetik olarak ilgisiz glikojen metabolize edici enzimleriiçerir 5. Bu, bu tür parçacıkların işlevi ve β-parçacıklar arasındaki potansiyel çapraz bağlayıcı ajanların doğası ile ilgili soruları gündeme getirmektedir5.
Glikojen molekül oluşumu 6,7,8,9 için iki karşıt matematiksel model önerilmiş olsa da, β parçacıklarının, büyük miktarlarda glikozun hızlı bir şekilde salınması için oldukça verimli bir yakıt rezervi olarak metabolik işlevlerine yanıt olarak evrimleştiği genel olarak kabul edilmektedir. Büyük bir kanıt grubu, suda sindirilebilirlik ve çözünürlük gibi glikojen özelliklerinin ortalama zincir uzunluğu (ACL) ile ilişkili olduğunu ve daha sonra dallanma noktalarının yüzdesini ve parçacık büyüklüğü 2,6,7,8,10,11’i belirleyeceğini göstermektedir. . ACL, toplam glikoz kalıntısı sayısı ile dallanma noktalarının sayısı arasındaki oranla tanımlanır. Tipik olarak, ACL değerleri ökaryotlarda ve prokaryotlarda sırasıyla 11-14 ve 7-23 glikoz kalıntıları arasında değişir,10. İnsanlarda, çeşitli glikojen bozukluğu hastalıkları anormal glikojen birikimine bağlıdır. Örneğin, Andersen hastalığı, bir glikojen dallanma enziminin eksik aktivitesi ile ilişkilidir ve anormal glikojen11’in birikmesine neden olur. Prokaryotlarda, kümülatif çalışmalar ACL’nin glikojen yıkım oranını ve bakteriyel sağkalım yeteneğini etkileyen kritik bir faktör olduğunu göstermektedir12,13. Düşük ACL değerine sahip β parçacıklarını sentezleyen bakterilerin daha yavaş bozunduğu ve bu nedenle açlık koşullarına daha uzun süre dayandığı bildirilmiştir. Bu nedenle, β parçacıklarının mimarisinin bilinmesi, insan glikojen depolama hastalıklarında anormal glikojen parçacıklarının oluşumunu ve besin eksikliği olan bir ortamda prokaryotların hayatta kalmasını anlamak için gereklidir.
On dokuzuncu yüzyılın sonlarında Fransız fizyolog Claude Bernard tarafından köpek karaciğerinden glikojen ilk izolasyonundanbu yana 14, glikojen parçacıklarını ayrıntılı olarak karakterize etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Örneğin, glikojen morfolojisi için transmisyon elektron mikroskobu (α veya β parçacıklar)15, α-1,6 bağlantılarının yüzdesini belirlemek için proton-NMR spektrometresi 16, moleküler ağırlığı çıkarmak için çoklu dedektörlü boyut dışlama kromatografisi, Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE)17 veya hem zincir uzunluğu dağılımı (CLD) hem de ACL için Darbeli Amperometrik Algılamalı Yüksek Performanslı Anyon değişim kromatografisi (HPAEC-PAD) belirleme18.
Bu çalışma, primer amin fonksiyonu ile hemiasetal grubun indirgeyici amination’ına dayanan florofor yardımlı karbonhidrat elektroforezi yöntemine odaklanmaktadır. Tarihsel olarak, 8-amino-1,3,6-naftalin trisülfonik asit (ANTS) ilk olarak etiketleme için kullanılmıştır. Daha sonra, daha hassas florofor, 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asit (APTS) 19 ile değiştirildi.
Resim 1: 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asit (APTS) ile indirgeyici aminasyon reaksiyonu. Hemasetal grubun, indirgeyici koşullar altında 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asidin (APTS) primer amin fonksiyonu ile indirgeyici aminasyon reaksiyonu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1’de gösterildiği gibi, bir glukan zincirinin indirgeyici ucunun hemiasetal fonksiyonu, indirgeme koşulları altında APTS’nin birincil amini ile etkileşime girer. APTS’nin sülfonik grupları, glukan zincirlerinin polimerizasyon derecelerine (DP) göre ayrılmasını sağlayan negatif yükler taşır. İndirgeyici amin reaksiyonu yüksek oranda tekrarlanabilir ve verimlidir. DP3 ila DP135 için ortalama %80 ve maltoz (DP2) ve glikoz için sırasıyla %88 ve %97’ye kadar17,20 verimlilik etiketi elde edilir. APTS’nin bir molekülü, her glukan zincirinin indirgeyici ucu ile reaksiyona girdiğinden, bireysel zincirler molar bazda ölçülebilir ve birbirleriyle karşılaştırılabilir.
Glikojen parçacıklarının fizikokimyasal özellikleri (örneğin, boyut, morfoloji, çözünürlük), parçacıkları oluşturan glukanların uzunluğu ile doğrudan ilişkilidir. Biyosentetik ve katabolik enzimler arasındaki herhangi bir dengesizlik, zincir uzunluğu dağılımının değişmesine ve kendi başına, hücre11 için tehlikeli olabilecek anormal glikojen birikimine neden olur. FACE analizi, glikojenin zincir uzunluğu dağılımını (CLD) belirlemek için tercih edilen bir yöntemdir. Şekil 2’de gösterildiği gibi, CLD’nin belirlenmesi, glikojen parçacıklarının yapısını yansıtan glikojen (ACL) ortalama zincir uzunluğu değerinin çıkarılmasına izin verir. Yüksek ACL değerlerine sahip hayvan glikojenleri, anormal parçacıkların ortaya çıkması ile ilişkilidir. Çıkarma analizi, farklı genetik geçmişlerden (mutantlara karşı vahşi tip) iki glikojen örneğini karşılaştırmak için yararlı bir yöntemdir. Logaritmik bir ölçekte çizim yaparak, CLD’ler maksimum zirveye normalleştirilmiş, diğer taraftan, CLD’yi bir referanstan bağımsız olarak karşılaştırma avantajına sahiptir ve bize büyüyen glikojen mekanizması hakkında bilgi vermiştir.
Ek olarak, FACE analizi, glikojen metabolize edici enzimlerin katalitik özelliklerini karakterize etmek için güçlü bir tekniktir. Örneğin, tüm glikojen dallanma enzimleri (1 → 4)-α bağlantılarını ayırır ve oligomaltosil gruplarını (1 → 6)-α pozisyonuna veya dallanma noktalarına aktarır. Dallanma enzimleri, polisakkaritlere (örneğin, amilopektin, glikojen) afiniteleri ve benzer katalitik mekanizmaya rağmen transfer edilen glukanların uzunluğu nedeniyle ayırt edilebilirler22. Böylece, çeşitli dallanma enzimleri kaynakları (insan, bitki, bakteri), FACE analizi23 kullanılarak bir dizi inkübasyon deneyi ve CLD karşılaştırmaları ile karakterize edilebilir ve sınıflandırılabilir.
Girişte belirtildiği gibi, HPAEC-PAD ayrıca zincir uzunluğu dağılımını belirlemek için alternatif bir yöntemdir18. Her iki teknik de, lineer glukan havuzunu polimerizasyon derecelerine (DP) göre ayırmadan önce (1 → 6)-α bağlantılarının veya dallanma noktalarının izoamilaz tipi dallanma enzimleri tarafından tam hidrolizini gerektirir. Bununla birlikte, HPAEC-PAD yöntemi, FACE’e kıyasla iki dezavantaj barındırır: (1) glukan zincirleri arttıkça amperometrik darbe yanıtı azalır, bu da nicel bilgi sağlamaz. Bu kütle yanlılığı sorunu, anyon değişim sütunu ile PAD24 arasında bir post-kolon enzim reaktörü içeren HPAEC-ENZ-PAD kullanılarak atlatılabilir. Kolon enzim reaktörü, malto-oligosakkaritleri glikoz kalıntılarına hidrolize ederek sabit bir darbe amperometrik tepkisine izin verir. (2) HPAEC-PAD, glukan zincirlerinin 70’e kadar polimerizasyon derecesi ile ayrılmasını sağlar. Çözünürlük, glikojen numunelerinin CLD’sini belirlemek için yeterli olsa da, FACE, nişasta numuneleri için uygun olan 150’ye kadar DP’li zincirleri ayırır17. Hem HPAEC-PAD hem de FACE analizinin artıları ve eksileri olduğunu akılda tutmak önemlidir. Örneğin, aminasyon reaksiyonu, APTS’nin birincil amin fonksiyonu ile reaksiyona girmek için serbest bir hemiasetal grup gerektirir. Bu, APTS etiketlemesinin, indirgeyici uçları olmayan glukan zincirleri (örneğin, inülin) için kullanılamayacağı anlamına gelir. HPAEC-PAD yöntemi, indirgeyici uçların varlığını gerektirmez. HPAEC-PAD yönteminin ikinci ilginç yönü, anyon değişim kolonunun birkaç miligram doğrusal glukan ile yüklenebilmesidir ve enzimatik tahlil18,25 için malto-oligosakkaritin spesifik bir DP veya 14C radyo etiketli malto-oligosakkarit ile saflaştırılmasına izin verir. Son olarak, kütle spektrometresi (örneğin, MALDI-TOF) zincir uzunluğu dağılımını belirlemek için hızlı ve hassas bir teknik olmasına rağmen, bu teknik daha az tekrarlanabilir görünmektedir. Uzun glukan zincirlerinin miktarını abartıyor26. Bununla birlikte, ikincisi, hücresel doku boyunca glikojen varlığını haritalamak için MALDI görüntüleme gibi belirli bir uygulama için kullanılabilir27.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma CNRS, Université de Lille CNRS tarafından desteklendi ve ANR “MathTest” (ANR-18-CE13-0027) verdi.
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |