Isolement des levures et des moisissures cultivables des sols pour étudier la structure de la population fongique
Summary
Ce protocole est une méthode efficace et rapide de culture des levures et de la moisissure Aspergillus fumigatus à partir de grands ensembles d’échantillons de sol en aussi peu que 7 jours. Les méthodes peuvent être facilement modifiées pour s’adapter à une gamme de milieux d’incubation et de températures au besoin pour les expériences.
Abstract
Le sol est l’hôte d’une quantité incroyable de vie microbienne, chaque gramme contenant jusqu’à des milliards de cellules bactériennes, archéales et fongiques. Les champignons multicellulaires tels que les moisissures et les champignons unicellulaires, définis au sens large comme des levures, jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes du sol en tant que décomposeurs de matières organiques et en tant que sources de nourriture pour les autres habitants du sol. La diversité des espèces fongiques dans le sol dépend d’une multitude de facteurs climatiques tels que les précipitations et la température, ainsi que des propriétés du sol, y compris la matière organique, le pH et l’humidité. Le manque d’échantillonnage environnemental adéquat, en particulier dans les régions d’Asie, d’Afrique, d’Amérique du Sud et d’Amérique centrale, entrave la caractérisation des communautés fongiques du sol et la découverte de nouvelles espèces.
Nous avons caractérisé les communautés fongiques du sol dans neuf pays sur six continents en utilisant environ 4 000 échantillons de sol et un protocole développé en laboratoire pour l’isolement des levures et des moisissures. Ce protocole commence par un enrichissement sélectif séparé pour les levures et la moisissure médicalement pertinente Aspergillus fumigatus, dans un milieu liquide tout en inhibant la croissance bactérienne. Les colonies résultantes sont ensuite transférées dans des milieux solides et traitées pour obtenir des cultures pures, suivies d’une caractérisation génétique en aval. L’identité des espèces de levures est établie par le séquençage de leur région interne d’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire, tandis que la structure de la population mondiale d’A. fumigatus est explorée par l’analyse de marqueurs microsatellites.
Le protocole a été appliqué avec succès pour isoler et caractériser les populations de levure du sol et d’A. fumigatus au Cameroun, au Canada, en Chine, au Costa Rica, en Islande, au Pérou, en Nouvelle-Zélande et en Arabie saoudite. Ces résultats ont révélé des informations indispensables sur les modèles mondiaux de diversité des levures du sol, ainsi que sur la structure de la population mondiale et les profils de résistance antifongique d’A. fumigatus. Cet article présente la méthode d’isolement des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol internationaux.
Introduction
Les champignons dans les écosystèmes du sol jouent un rôle essentiel dans la décomposition de la matière organique, le cycle des nutriments et la fertilisation du sol1. Les approches indépendantes de la culture (c.-à-d. séquençage à haut débit) et dépendantes de la culture sont largement utilisées dans l’étude des champignons du sol 2,3. Bien que la grande quantité de données générées par le séquençage de métacodes à barres à haut débit soit utile pour élucider les modèles à grande échelle de la structure et de la diversité des communautés, l’approche dépendante de la culture peut fournir des informations très complémentaires sur les structures taxonomiques et fonctionnelles des communautés fongiques, ainsi que des profils plus spécifiques d’organismes individuels grâce à la diversité en aval et aux analyses fonctionnelles en raison de la disponibilité de cultures fongiques pures.
Bien qu’elles dépassent rarement des milliers de cellules par gramme de sol, les levures, définies au sens large comme des champignons unicellulaires, sont des décomposeurs essentiels et des sources de nourriture pour les autres habitants du sol 4,5. En fait, les levures peuvent être les champignons du sol prédominants dans les biosphères froides telles que l’Antarctique continental 6,7. Le sol est également un réservoir primaire de levures médicalement pertinentes qui causent de graves infections opportunistes chez les humains et d’autres mammifères8. Malgré les similitudes morphologiques, les espèces de levures sont phylogénétiquement diverses et se trouvent parmi les champignons filamenteux dans deux phylums majeurs, Ascomycota et Basidiomycota, dans le règne fongique9. Les levures n’ont pas de signature ADN déterminante au niveau du gène de codage à barres fongique, la région interne de l’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire10, ce qui les rend impossibles à distinguer des autres champignons dans les études métagénomiques et nécessite donc l’utilisation de méthodes dépendantes de la culture pour isoler les espèces de levure.
Le protocole ci-dessous a été mis en œuvre pour caractériser les communautés de levures du sol de neuf pays et identifier les tendances et les modèles mondiaux de la diversité des levures du sol 9,11,12. Les approches métagénomiques sont d’une utilité limitée pour étudier des groupes ciblés d’organismes tels que les levures 2,3. En raison de leur diversité phylogénétique, les levures ne peuvent pas être distinguées des autres champignons sur la base de la seule séquence d’ADN. Ainsi, l’étude des populations de levures nécessite l’utilisation continue de l’isolement dépendant de la culture. Cependant, la culture prend souvent beaucoup plus de temps et nécessite plus de personnel pour effectuer les expériences. Par conséquent, le protocole a été optimisé et rationalisé pour un traitement plus rapide avec un personnel limité. Le principal avantage de la culture est que les espèces de levures identifiées sont des levures vivantes et non mortes, et sont donc plus susceptibles d’être de vrais habitants du sol plutôt que des cellules transitoires présentes dans les sols. On estime qu’environ 40 % de l’ADN fongique dans le sol est soit constitué de contaminants provenant d’autres environnements, soit extracellulaires, soit provenant de cellules qui ne sont plus intactes, ce qui entraîne des approches de séquençage à haut débit pour surestimer la richesse fongique jusqu’à 55 %13. L’isolement dépendant de la culture peut facilement confirmer l’identité des espèces de levures avec l’avantage supplémentaire de garantir une culture pure à utiliser dans les analyses en aval. En effet, des cultures pures de 44 nouvelles espèces de levures putatives ont été identifiées à l’aide de ce protocole d’isolement du sol qui a permis l’utilisation d’une gamme de méthodes pour étudier en détail leurs propriétés taxonomiques et fonctionnelles14.
Le protocole ci-dessous peut également être utilisé pour isoler les moisissures présentes dans le sol, telles que A. fumigatus. Aspergillus fumigatus est une moisissure thermophile et saprophyte avec une large distribution mondiale dans le sol15. Il a été isolé dans de nombreux environnements cliniques et non cliniques. L’échantillonnage non clinique comprend généralement l’air, les débris organiques (compost, sciure de bois, déchets de bulbes de tulipes) et le sol (sols agricoles, de jardin et naturels)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus est un agent pathogène opportuniste humain causant une gamme d’infections collectivement appelées aspergillose, affectant plus de 8 millions de personnes dans le monde16,20. Environ 300 000 personnes dans le monde souffrent d’aspergillose invasive, qui est la forme la plus grave d’aspergillose16. Selon des facteurs tels que la population de patients, le site de l’infection et l’efficacité du traitement antifongique, le taux de mortalité peut atteindre 90%. Au cours des dernières décennies, la résistance aux thérapies antifongiques a augmenté, nécessitant des efforts de surveillance mondiale dans les populations cliniques et environnementales pour suivre ces génotypes de résistance 21,22,23. Compte tenu de sa capacité à croître à des températures supérieures à 50 °C, cette température peut être exploitée pour sélectionner des isolats d’A. fumigatus dans le sol en utilisant des méthodes dépendantes de la culture. Les isolats d’Aspergillus fumigatus sont généralement génotypés à neuf loci à répétition courte en tandem (STR) hautement polymorphes, dont le pouvoir discriminatoire est élevé entre les souches24. Ces génotypes STR peuvent être comparés à d’autres populations précédemment étudiées pour suivre la propagation des génotypes d’A. fumigatus, y compris les gènes de résistance aux médicaments, dans le monde entier.
Nous décrivons ci-dessous un protocole pour l’isolement rapide des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol en fonction de la culture. Selon la quantité de sol obtenue par échantillon, les échantillons de sol peuvent être partagés entre les deux protocoles. Par rapport à des méthodes similaires qui isolent la levure et A. fumigatus du sol, ce protocole utilise 10 fois moins de sol par isolat obtenu. Les études visant à isoler A. fumigatus du sol nécessitent entre 1 et 2 g de sol par isolat, alors que ce protocole ne nécessite que 0,1 à 0,2 g de sol 18,19,25. Ce protocole utilise des plastiques et des conteneurs plus petits qui facilitent sa conception à haut débit. Par conséquent, un plus grand nombre d’échantillons peuvent être traités en utilisant moins d’espace pour les équipements tels que les incubateurs et les tambours à rouleaux. Les échantillons de sol peuvent être entièrement traités pour obtenir des isolats en aussi peu que 7 jours. Ce protocole a été optimisé pour permettre le traitement de jusqu’à 150 à 200 échantillons par jour et par personne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole développé pour isoler les levures et A. fumigatus du sol est une méthode rapide et efficace pour le traitement du sol à haut débit et l’isolement fongique. Le protocole ne nécessite qu’une petite quantité de sol (0,1-0,2 g) par échantillon, ce qui permet d’échantillonner plus de sites avec un effort similaire. Le délai d’exécution rapide garantit que les résultats peuvent être obtenus dans un court laps de temps et laisse le temps de dépanner et de répéter les expériences si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no. ALLRP 570780-2021) et l’Université McMaster.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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