Hurtig Golgi-plet til dendritisk rygsøjlevisualisering i Hippocampus og præfrontal cortex

Summary

Protokollen beskriver en modifikation af den hurtige Golgi-metode, som kan tilpasses enhver del af nervesystemet, til farvning af neuroner i rottens hippocampus og mediale præfrontale cortex.

Abstract

Golgi-imprægnering, ved hjælp af Golgi-farvningssættet med mindre tilpasninger, bruges til at imprægnere dendritiske rygsøjler i rottefloppocampus og mediale præfrontale cortex. Denne teknik er en markant forbedring i forhold til tidligere metoder til Golgi-imprægnering, fordi de forblandede kemikalier er sikrere at bruge, neuroner er konsekvent godt imprægneret, der er langt mindre baggrundsaffald, og for en given region er der ekstremt små afvigelser i rygsøjletætheden mellem eksperimenter. Desuden kan hjerner akkumuleres efter et bestemt punkt og holdes frosne indtil videre behandling. Ved hjælp af denne metode kan enhver hjerneregion af interesse undersøges. Når dendritisk rygsøjle er plettet og dækket gled, bestemmes dendritisk rygsøjletæthed ved at tælle antallet af rygsøjler for en længde dendrit og udtrykkes som rygsøjletæthed pr. 10 μm dendrit.

Introduction

Metoden til at anvende kaliumdichromat og sølvnitrat til at mærke neuroner blev først beskrevet af Camillo Golgi ^1,2 og efterfølgende brugt af Santiago Ramon y Cajal til at producere en enorm mængde arbejde, der differentierer neuronale og gliale undertyper. En nyligt udgivet bog med hans illustrationer er nu tilgængelig³. Efter Ramon y Cajals undersøgelser, som blev offentliggjort for mere end 100 år siden, blev der brugt meget lidt Golgi-imprægnering. Golgi imprægnering er en besværlig proces, der muliggør tredimensionel visualisering af neuroner med et lysmikroskop. Der har været adskillige ændringer af Golgi-metoden gennem årene for at gøre metoden lettere og farvningen mere konsistent⁴. I 1984 beskrev Gabbott og Somogyi⁵ Golgi-imprægneringsproceduren med et enkelt afsnit, som muliggjorde hurtigere behandling. Denne Golgi-imprægneringsmetode kræver perfusion med 4% paraformaldehyd og 1,5% picrinsyre, efterfiksering efterfulgt af vibratomsektionering i et bad med 3% kaliumdichromat. Sektioner er monteret på glasrutschebaner, de fire hjørner af dæksler limes, så diffusionen er gradvis, når den nedsænkes i sølvnitrat. Coverslips poppes derefter af, sektioner dehydreres, og til sidst glider dækslet permanent med monteringsmedium. Denne teknik blev med succes brugt til at mærke neuroner og glia ^6,7,8 i hippocampus. Den hurtige Golgi-metode, der er beskrevet her, er en forbedring, fordi der er langt mindre eksponering for både kaliumdichromat og sølvnitrat, og der anvendes ingen paraformaldehyd og picrinsyre. Derudover, selvom celler, der blev imprægneret ved hjælp af modifikationer af Gabbott- og Somogyi^5-metoden, kunne analyseres, var sektionerne ofte over- eller undereksponerede eller faldt af diasene under dehydreringstrinnet, og generelt måtte flere eksperimenter samles for at have nok celler til analyse.

Den nuværende protokol beskriver brugen af Golgi-farvningssættet (se tabel over materialer) til mærkning af dendritter og dendritiske rygsøjler i rottens hippocampus og mediale præfrontale cortex (mPFC). Fordelene ved denne metode i forhold til tidligere er, at den er hurtig, der er mindre eksponering for skadelige kemikalier for forskeren, og der er konsekvent farvning af neuroner. Protokollen beskrevet nedenfor er blevet anvendt med mindre ændringer til at vurdere dendritisk rygsøjletæthed i rottens hippocampus og mPFC i mange undersøgelser 9,10,11,12,13,14,15.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer er godkendt af Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee og er i overensstemmelse med NIH Guide for the Care and Use of Animals. 1. Isolering og infiltration af hjernevæv Forblandingsopløsning A og B i Golgi-farvningssættet 24 timer før brug og opbevares i mørke flasker og/eller i mørke. Der fremstilles ca. 80 ml opløsning A- og B-blanding, hvilket er tilstrækkeligt til at ændre opløsningen efter 24 …

Representative Results

Ved hjælp af den hurtige Golgi-metode imprægneres cellerne konsekvent godt, så der er masser af celler at analysere. Dette er en markant forbedring i forhold til tidligere metoder, hvor eksperimenter skulle samles for at have nok data til analyse. Derfor kan flere prøver behandles på én gang, og hjerner kan opbevares frosne indtil forarbejdning. Eksempler på Golgi-imprægnerede celler i CA1-regionen i hippocampus er vist ved lav og høj effekt i figur 3. Optælling af rygsøjler i en …

Discussion

Den nuværende protokol beskriver en metode til Golgi-imprægnering, der muliggør hurtig samtidig behandling af mange sektioner. Det er en forbedring i forhold til tidligere beskrevne⁵ mere arbejdskrævende metoder og giver konsekvent imprægnerede neuroner til analyse. Derudover er der mindre eksponering for giftige kemikalier, der anvendes i Golgi-imprægnering. Den mest udfordrende del af processen er at få sektionerne til at være flade på diasene, hvilket kræver betydelig øvelse. Det er …

Materials

Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck