海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色
Summary
プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。
Abstract
ゴルジ体含浸は、軽微な適応を伴うゴルジ染色キットを使用して、ラット海馬および内側前頭前野の樹状突起棘を含浸させるために使用される。この技術は、予め混合された化学物質がより安全に使用でき、ニューロンが一貫して良好に含浸され、バックグラウンド破片がはるかに少なく、所与の領域について、実験間の脊椎密度の偏差が非常に小さいため、ゴルジ体含浸の以前の方法よりも顕著な改善である。さらに、脳はある時点以降に蓄積され、さらなる処理まで凍結し続けることができます。この方法を用いて、任意の脳の関心領域を研究することができる。一度染色され、カバーが滑ると、樹状突起脊椎密度は、樹状突起の長さに対する棘の数を数えることによって決定され、樹状突起10μmあたりの背骨密度として表される。
Introduction
ニューロンを標識するために重クロム酸カリウムと硝酸銀を使用する方法は、Camillo Golgi 1,2によって最初に記載され、続いてサンティアゴ・ラモン・イ・カハールによってニューロンおよびグリアのサブタイプを区別する膨大な量の仕事を生み出すために使用された。最近出版された彼のイラスト入りの本が発売されました3.100年以上前に発表されたラモン・イ・カハールの研究に続いて、ゴルジの含浸はほとんど使用されなかった。ゴルジ体含浸は、光学顕微鏡でニューロンを3次元的に可視化することを可能にする面倒なプロセスです。ゴルジ法には、方法をより簡単にし、染色をより一貫性のあるものにするために、長年にわたって多数の修正が加えられてきました4。1984年、GabbottとSomogyi5は、より迅速な処理を可能にする単一セクションのゴルジ含浸手順を説明しました。このゴルジ体含浸法では、4%パラホルムアルデヒドと1.5%ピクリン酸による灌流、固定後、3%重クロム酸カリウムの浴にビブラトーム切片が必要です。切片はスライドガラスに取り付けられ、カバースリップの四隅は硝酸銀に浸すと拡散が緩やかになるように接着されています。その後、カバースリップがはじけ、セクションが脱水され、最終的にカバーがマウント媒体で永久に滑り落ちます。この技術は、海馬のニューロンおよびグリア6,7,8を標識するために首尾よく使用された。ここで説明する迅速なゴルジ法は、重クロム酸カリウムと硝酸銀の両方への曝露がはるかに少なく、パラホルムアルデヒドとピクリン酸が使用されていないため、改善点です。さらに、Gabbott and Somogyi5法の改変を用いて含浸させた細胞を分析することはできたが、脱水工程中に切片が過剰または露出不足であったり、スライドから落ちたりすることが多く、一般に、分析に十分な細胞を得るためにいくつかの実験をプールする必要があった。
本プロトコールは、ラットの海馬および内側前頭前野(mPFC)における樹状突起および樹状突起棘を標識するためのゴルジ染色キット(材料表を参照)の使用を記載している。以前の方法に対するこの方法の利点は、それが迅速であり、研究者にとって有害な化学物質への曝露が少なく、ニューロンの一貫した染色があることです。以下に記載するプロトコールは、多くの研究9、10、11、12、13、14、15においてラットの海馬およびmPFCにおける樹状突起脊椎密度を評価するために軽微な修正を加えて使用されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルは、多くのセクションの迅速な同時処理を可能にするゴルジ体含浸の方法を記載している。これは、前述の5 つのより労働集約的な方法に対する改善であり、分析のために一貫して含浸ニューロンをもたらす。さらに、ゴルジ体含浸に使用される有毒化学物質への暴露が少なくなります。このプロセスの最も困難な部分は、スライド上でセクションを平坦にす?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、セイクリッドハート大学学部研究イニシアチブ助成金によって支援されました。
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
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