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Biology

原子スケールのステッピングから粗粒拡散までのDNAに沿った転写因子タンパク質移動の構造ベースのシミュレーションとサンプリング

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63406
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 4, 5,6,7
1Beijing Computational Science Research Center, 2Shenzhen JL Computational Science and Applied Research Institute, 3School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 4Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 5Department of Physics and Astronomy, University of California, Irvine, 6Department of Chemistry, University of California, Irvine, 7NSF-Simons Center for Multiscale Cell Fate Research, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコールの目標は、植物転写因子WRKYドメインタンパク質を例示的な系として用いて、DNAに沿ったタンパク質の1次元拡散の構造ダイナミクスを明らかにすることである。これを行うために、原子論的および粗粒度の分子動力学シミュレーションと広範な計算サンプリングの両方が実装されています。

Abstract

DNAに沿った転写因子(TF)タンパク質の1次元(1-D)スライディングは、遺伝子調節のために標的DNA部位を位置特定するためのTFの拡散を促進するために不可欠である。DNAをスライドまたは踏むTFの塩基対(bp)分解能を検出することは、依然として実験的に困難です。我々は最近、DNAに沿った小さなWRKYドメインTFタンパク質の自発的な1-bpステッピングを捕捉する全原子分子動力学(MD)シミュレーションを行った。このようなシミュレーションから得られた10μsのWRKYステッピング経路に基づいて、ここでのプロトコルは、1-bpタンパク質ステッピングのためのマルコフ状態モデル(MSM)を構築し、MSM構築のために様々な数のミクロおよびマクロ状態をテストすることによって、TF-DNAシステムのより広範な立体構造サンプリングを行う方法を示す。DNAに沿ったTFタンパク質のプロセス的1次元拡散探索を構造的基礎とともに調べるために、このプロトコルはさらに、システムの長期スケールのダイナミクスをサンプリングするために粗粒(CG)MDシミュレーションを行う方法を示す。このようなCGモデリングおよびシミュレーションは、全原子シミュレーションから明らかにされたサブマイクロ秒からマイクロ秒のタンパク質ステッピング運動と比較して、数十マイクロ秒を超えるTFタンパク質のプロセス拡散運動に対するタンパク質-DNA静電的影響を明らかにするのに特に有用である。

Introduction

転写因子(TF)は、遺伝子転写および関連活性を結合および調節する標的DNAを探索する1.3次元(3D)拡散とは別に、TFの促進された拡散は、タンパク質が1次元(1D)DNAに沿ってスライドまたはホップしたり、DNA上のセグメント間転写でジャンプしたりすることができる標的DNA探索に不可欠であることが示唆されている2、3、4、5、6、7。

最近の研究では、DNA上のWRKYドメインタンパク質である植物TFについて、数十マイクロ秒(μs)の全原子平衡分子動力学(MD)シミュレーションを実施しました8。マイクロ秒以内にポリA DNA上のWRKYの完全な1-bpステッピングがキャプチャされました。DNA溝に沿ったタンパク質の動きと水素結合(HB)の破壊・改質ダイナミクスが観察されている。このような軌道は1つのサンプリングされた経路を表しますが、全体的なタンパク質ステッピングランドスケープはまだ欠けています。ここでは、実質的な立体構造変化および時間スケール分離9、10、11、12、13、14、15、16を含む様々な生体分子系をシミュレートするために広く実装されている構築されたマルコフ状態モデル(MSM)を用いて、最初に捕捉されたタンパク質ステッピング経路の周りの計算サンプリングを拡張する方法を示し、17,18,19。その目的は、1つの環状ステップのためのDNAに沿ったTFタンパク質拡散の立体構造アンサンブルおよび準安定状態を明らかにすることである。

上記のMDシミュレーションは、DNA上の1 bpのタンパク質移動の原子分解能を明らかにしているが、同じ高分解能でのDNAに沿ったTFの長時間のプロセス拡散の構造ダイナミクスはほとんどアクセスできない。しかし、残留物レベルで粗粒度(CG)MDシミュレーションを実施することは、技術的には親しみやすいことです。CGシミュレーションの時間スケールは、原子シミュレーション20、21、22、23、24、25、26、27、28、29よりも数十倍または数百倍の長さに効果的に拡張することができる。ここでは、高田研究室30が開発したCafeMolソフトウェアを実装して行ったCGシミュレーションを紹介します。

現在のプロトコルでは、ポリA DNAに沿ったWRKYドメインタンパク質の原子シミュレーションと、DNAに沿ったわずか1 bpのタンパク質ステッピング運動のサンプリングに焦点を当てたMSM構築を最初に提示する。次に、同じタンパク質-DNA系のCGモデリングとシミュレーションを提示し、計算サンプリングをDNAに沿って数十bpsにわたるタンパク質プロセス拡散に拡張します。

ここでは、GROMACS 31,32,33ソフトウェアを使用してMDシミュレーションを行い、MSMbuilder 34を使用してサンプリングされた立体構造スナップショット用のMSMを構築し、VMD 35を使用して生体分子を視覚化します。このプロトコルでは、ユーザーが上記のソフトウェアをインストールして実装できる必要があります。CG MDシミュレーションを行うには、CafeMol30ソフトウェアのインストールと実装が必要です。軌道のさらなる分析と視覚化もVMDで行われます。

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Protocol

1. 原子MDシミュレーションによるマルコフ状態モデル(MSM)の構築

  1. 自発的なタンパク質ステッピング経路と初期構造収集
    1. 以前に取得した10μsの全原子MD軌道8 を使用して、「順方向」の1bpステッピングパス(すなわち、ナノ秒ごとに1フレーム)から10000フレームを均等に抽出する。フレームの総数は、すべての代表的な立体配座を含むのに十分な大きさである必要があります。
    2. VMDで10000フレームの遷移パスを準備する には、[ファイル]>[座標を保存し、選択した原子にタンパク質または核酸を入力し]ボックスに入力し、[フレーム]ボックスで[ 保存 ]をクリックして必要なフレームを取得します。
      注:34 bpの均質なポリA DNA8上のWRKYステッピング1-bp距離について、以前に得られた10μsの全原子MDシミュレーション軌道(ここでは「順方向ステッピング軌道」と呼ばれる)を、さらなる立体構造サンプリングを開始するための初期経路として使用した。ただし、ほとんどのプラクティスでは、ステアリングまたはターゲットを絞ったMDシミュレーションを実行したり、一般的なパス生成方法などを実装することによって、初期パスが構築されることに注意してください36,37,38,39。
    3. 参照DNAの長軸(結晶構造から)をx軸に揃え、完全な34bpDNAの初期質量中心(COM)を座標空間の原点に設定して、さらなるデータ解析を容易にします。これを行うには、VMD の Tk コンソール >拡張機能をクリックし、Tk コンソール のコマンド ウィンドウに次のように入力します。
      ソース rotate.tcl
      tcl スクリプトは 補足ファイル 3 にあります。
    4. 次に、中央10 bp DNA(A14〜23およびT14'〜23')を結晶構造40からのものに整列させることによってタンパク質骨格の二乗平均平方根距離(RMSD)を計算し、RMSDは系の幾何学的測定値を表す( 図1A参照)。これを行うには、 RMSD 軌道ツール> VMD > Extensions > Analysis をクリックし、原子選択ボックスに核酸と残基 14 ~ 23 および 46 ~ 55 と入力し、[ 整列 ] をクリックしてから RMSD ボックスをクリックして RMSD 値を計算します。
    5. コマンドを入力して、MATLABのy-z平面上のDNA Θ(t)の周りのタンパク質の回転度を計算します。
      rad2deg(atan(z/y))
      初期角度位置決めは、以前に実施したようにΘ(0)=0として定義される8。
    6. MATLAB41 に次のコマンドを入力して、K-means メソッド42,43,44 を使用し、次のように入力して 10000 個の構造体を 25 個のクラスターに分類します。
      [idx, C]=kmeans( X, 25)
      ここで X は、DNA上のRMSDとWRKYの回転角の2D行列である。これらの25のクラスタ中心の構造を収集して、さらなるMDシミュレーションを行います。
      注:DNAに対してサンプリングされたタンパク質RMSDは約25オングストロームの範囲をカバーするため、オングストロームごとに1つのクラスターを持つように25個のクラスターを選択します。
  2. 第1ラウンドのMDシミュレーションとシミュレーション設定の実施
    1. parmbsc1 力場45 の下で GROMACS 5.1.2 ソフトウェア32 を使用し、シェルの補足ファイル 2 の buildsystem.sh ファイルを使用して、25 の構造の原子論的システムを構築します。
    2. シェルで次のコマンドを入力して、NPT アンサンブルの下でこれらの 25 システムの 60 ns MD シミュレーションを 2 fs の時間ステップで実行します。
      gmx_mpi grompp -f md.mdp -c npt.gro -p topol.top -o md.tpr
      gmx_mpi mdrun -deffnm md
  3. 1のクラスタリング聖 ラウンドMD軌道
    1. 各シミュレーション軌道の最初の 10 ns を削除するには、シェルに次のように入力します。
      gmx_mpi trjcat -f md.xtc -b 10000 -e 600000 -o newtraj.xtc
      クラスタリングのために25 ns×50 nsの軌道から立体構造を収集し、その後のより広範なサンプリング(2回目の MDシミュレーション)のために入力構造を準備します。
      注: 初期パスからの影響を軽減し、局所的な平衡化を可能にするために、シミュレーションの初期期間の 10 ns が削除されました。
    2. 時間非依存成分分析(tICA)46,47,48投影の入力パラメータとしてタンパク質とDNAの間の距離ペアを選択します。これを行うには、GROMACS で make_ndx コマンドを使用します。
      gmx_mpi make_ndx -f 入力.pdb -o index.ndx
      注:ここでは、DNAヌクレオチドと水素結合(HB)を形成できるタンパク質CA原子および残基Y119、K122、K125、R131、Y133、Q146、K144、R135、W116、R117、Y134、K118、Q121の重原子(NH1、NH2、OH、NZ、NE2、ND2)を選択し、DNAヌクレオチドのO1P O2PおよびN6原子と対をなすもの(A14-20、 T19-23)。選択されたアミノ酸は、DNAと安定なHBまたは塩架橋を形成することができる。
    3. 上記の選択したアトム インデックスを index.ndx ファイルから新しいテキスト ファイル (index.dat) にコピーします。 補足ファイル1 のgenerate_atom_indices.pyからPythonスクリプトによってこれらの原子間のペア情報を取得し、次のように入力します。
      python2.6 generate_atom_indices.py index.dat > AtomIndices.txt
      これにより、タンパク質とDNAの間に415の距離ペアが生成されます。
    4. MSMbuilder コマンド ウィンドウで次のコマンドを入力して、すべての軌道から 415 の距離ペアを計算します。
      msmb AtomPairsFeaturizer -out pair_features --pair_indices AtomIndices.txt --top references.pdb --trjs "trajectories/*.xtc" --transformed pair_features --stride 5
    5. tICAを実行して、次のように入力して、最初の2つの時間非依存コンポーネント(tIC)またはベクトルにデータの次元を縮小します。
      msmb tICA -i ../tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --γ 0.05 -t tica_results.h5
      注:tICAは、時間時間差相関行列 Equation 1 の固有値を計算し、シミュレーションシステムの最も遅い緩和自由度を次の式で決定する次元縮小方法です。
      Equation 2
      ここで、XI(t)は時刻tにおけるi番目の反応座標の値であり、Xj(t+Δt)は時刻t+Δtにおけるj番目の反応座標の値である。Equation 3は、XI(t) と Xj(t + Δ t) 全体のシミュレーション軌道の積の期待値です。最も遅い緩和自由度に沿った方向は、上記の時間時間差相関行列Equation 1の最大の固有値に対応します。ここで、2つのtICは、MSM構築時に3つのマクロ状態を区別するための最小セットのようです(後述)。一般化行列レイリー商(GMRQ)スコア49を計算して、例えば、使用される成分の最適なセットを探索することもできる。
    6. MSMbuilder のコマンドを使用して、K センター43,44 メソッドによって投影データセットを 100 個のクラスターにクラスター化します (図 1B を参照)。
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 100.
      各クラスタの中心構造を、第 2 ラウンドの MD シミュレーションの初期構造として選択します。速度を除いて、位置、温度、圧力などを含むシミュレートされた100の構造のシミュレーション情報を維持します。
      注: 25 回のシミュレーションの最初のラウンドの後、初期パスのメモリが削減されたため、コンフォメーション サンプリングを大幅に拡張するために、2 回目のラウンドでより多くのクラスター (たとえば、100 個のクラスター) を生成します。
  4. 第2ラウンドの広範なMDシミュレーションの実施
    1. これら100の初期構造から始めて、すべての原子にランダムな初期速度を課した後、60nsのMDシミュレーションを行います。mdp ファイルの速度生成をオンにすることによって、つまり md.mdp ファイルを gen_vel = no から gen_vel = yes に変更することによって、ランダムな初期速度を追加します。
    2. 手順 1.3.1 で説明したように、各シミュレーションの最初の 10 ns を削除し、100 ~ 50 ns の軌道から 2,500,000 個のスナップショットを均等に収集して、MSM ×構築します。
      注: 後のマクロステート構築では、特に低い母集団(X-Θ平面の底部で〜0.2%)を持つ少数のオフパス状態が見つかったことに注意してください。これらのオフパス状態は、マクロ状態の合計数が 3 ~ 6 に設定されている場合、1 つのマクロ状態として分類されます (図 2B)。このような低母集団のマクロステートは、最終的に除去された3つの軌道のみを含むので、このプロトコルに示された結果は、97×50nsの軌道から実際に得られ、合計2,425,000フレームまたはスナップショットを有する。
  5. 第 2 ラウンド MD 軌道のクラスタリング
    1. 前回と同様に、第 2 ラウンドの軌道に対して tICA を実行します。MSMビルダーに次のように入力します。
      msmb tICA -i ../tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --γ 0.05 -t tica_results.h5
    2. 暗黙のタイムスケールを計算して、相関遅延時間Δtとマイクロステート数のパラメータを検証します( 図1C参照)。
      Equation 4
      ここで、τは遷移確率行列(TPM)の構築に使用されるラグタイムを表します。μk(τ) は、τ のラグタイム下での TPM の k 番目の固有値を表します。この Python には 、補足ファイル 1 の Python スクリプト BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d を使用します。/ -f ../trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 10 -n 20 -s 500.
    3. ラグタイムτとマイクロステートの数を変えるには、上記で使用したパラメータを変更します。
      python BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d ../ -f ../trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 5 10 20 30 40 -n 20 -s 20 200 400 500 800 2000
      注: 暗黙のタイムスケール曲線がタイムスケール分離で横ばいになり始めると、システムはマルコビアンと見なされます。次に、相関遅延時間として Dt を選択し、MSM を構築するために暗黙のタイムスケールが横ばいになり始めるラグタイムを τ を選択します。
    4. したがって、比較的大きい(ただし大きすぎない)状態数、N = 500、および比較的短い相関遅延時間Δt = 10nsを選択します。MSMを構築するためのラグタイムはτ = 10nsであることが判明しました。
    5. 次のコマンドを使用して、コンフォメーションを 500 個のクラスターに分類します ( 図 1D を参照)。
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 500
  6. MSMの構造
    1. 500 個のマイクロステートを 3 ~ 6 個のマクロステートにまとめて、MSMbuilder の PCCA+ アルゴリズム50 に最も適したマクロステートの数を、補足ファイル 1 の python msm_lumping_usingPCCAplus.pyの python スクリプトを使用して見つけます。少数のマクロステートを構築することによって、すなわち、下記17、51のように何百ものミクロステートを速度論的に集中させることによって、生体分子の最も重要な立体構造変化のためのモデルの縮小された動力学的ネットワークを同定する。
    2. ステップ1.1.3および1.1.4で説明したように、各マクロ状態について、高次元立体配座をX(DNA長軸に沿ったタンパク質移動)およびDNAに沿ったタンパク質の回転角度にマッピングする(例えば、集団が1%<低すぎる状態がない; 図2Cを参照)。次に、システムを最もよく表す3つのマクロ状態を見つけます(図1E)。DNAに沿ったタンパク質の動きとDNA周りのタンパク質回転角度のスナップショットについては、 図2D を参照してください。
      注:10 μsの自発的なタンパク質の順方向ステッピング経路を生成する以前の研究では、サンプリングを適度に拡張するために、5 x 4 μsの平衡MDシミュレーションをさらに実施しました。元の順方向経路(図2A左参照)と、以前に実施した順方向経路上のさらに4μsサンプリング軌道(図2A右参照)のマッピングを示しました8。この作業で使用した元の100 × 50 nsのマッピング(図2B左参照)8と、この作業で使用した97 × 50 nsの軌道を示しています(図2B右参照)。
  7. 平均初回通過時間(MFPT)の計算
    1. MC の時間ステップとしてラグタイムを 10 ns に設定して、500 マイクロステート MSM の TPM に基づいて 5 つの 10 ミリ秒のモンテカルロ (MC) 軌道を実行します。補足ファイル 1 python python mfpt_msm3.py の python スクリプトを使用して、マクロ状態の各ペア間の MFPT52 を計算します (図 3)。
    2. 補足ファイル 2 の bash ファイルを使用して MFPT の平均誤差と標準誤差を計算し、次のように入力します。
      sh mfpt_analysis.bash

2. 長時間のダイナミクスをサンプリングするための粗粒度(CG)シミュレーションの実施

  1. CafeMol 3.0ソフトウェア30を用いてCGシミュレーションを行う。入力構成ファイルで指定されている CG シミュレーション設定 (入力構造、シミュレーション・パラメーター、出力ファイルなどを含む) を拡張子 .inp で確認してください。端末で次のコマンドを入力して、CG シミュレーションを実行します。
    カフェモール XXX.inp
  2. 入力ファイルで以下のブロックを指定し、各ブロックはラベル < and ending with >>>>で始まります。
    1. ファイル名ブロック (必須) を設定して、作業ディレクトリと入出力ファイルストアパスを指定します。これらのシミュレーションのファイル名ブロックに次のように入力します。
      ファイル名の<<<<
      パス = XXXXX (作業パス)
      ファイル名 = wrky (出力ファイル名)
      出力 psf pdb ムービー dcd rst
      path_pdb = XXXXX (入力ネイティブ構造パス)
      path_ini = XXXXX (入力初期構造パス)
      path_natinfo = XXXXX (ネイティブ情報ファイルのパス)
      path_para = XXXXX (パラメーター・ファイル・パス)
      >>>>
      注:Go-model53 はCGモデリングに利用されるため、すなわち、タンパク質は天然の立体構造に偏るため、モデル化された構造を天然の立体構造として設定する必要がある。ここで、入力結晶構造は、天然の立体構造として設定した。
    2. ジョブ制御ブロック(必須)を設定して、シミュレーションの実行モードを定義します。次のコマンドを入力します。
      <<<< job_cntl
      i_run_mode = 2 (= 2 定温シミュレーション)
      i_simulate_type = 1 (=1 ランジュバンダイナミクス)
      i_initial_state = 2 (=2 は初期構成がネイティブ構成であることを意味します)
      >>>>
      定温ランジュバンダイナミクスシミュレーションを選択します。
    3. 単位ブロックと状態ブロック (必須) を設定して、入力構造の情報を定義します。次のコマンドを入力します。
      <<<< unit_and_state
      i_seq_read_style = 1 (=1 は PDB ファイルからのシーケンスの読み取りを意味します)
      i_go_native_read_style = 1 (=1 はネイティブ構造が PDB ファイルからのものであることを意味します)
      1 タンパク質タンパク質.pdb(単位と状態molecular_type native_structure)
      2-3 DNA.pdb (ユニット&ステートmolecular_type native_structure)
      >>>>
      注: 初期入力構造ファイル (タンパク質.pdbおよび DNA.pdb はこちら) が必要です。構造体は pdb 形式で記述されます。ここでは 2 つの pdb ファイルが必要です: 1 つは WRKY の重原子座標を含むタンパク質構造ファイル(ユニット 1)、もう 1 つは 200 bp の二本鎖 (ds) DNA (ユニット 2-3) の座標です。タンパク質は、最初はDNAから15オングストローグメートル離れた位置に配置されます。
    4. energy_functionブロックに定義されているエネルギー関数ブロック(必須)を設定します。次のコマンドを入力します。
      <<<< energy_function
      ローカル(1) L_GO
      ローカル(2-3) L_DNA2
      NLOCAL(1/1) GO EXV ELE
      NLOCAL(2-3/2-3) ELE DNA
      NLOCAL(1/2-3) EXV ELE
      i_use_atom_protein = 0
      i_use_atom_dna = 0
      i_para_from_ninfo = 1
      i_triple_angle_term = 2
      >>>>
      注:CGシミュレーションでは、タンパク質はGoモデル53によって粗粒化され、CG 粒子で表される各アミノ酸はそのCα位置に配置される。タンパク質の立体構造は、Goポテンシャルの下で天然の構造、またはここでは結晶構造に向かって偏ります(図4A 左)。DNAは3SPN.2モデル54によって記述され、各ヌクレオチドは、それぞれ糖、リン酸、および窒素塩基に対応する3CG粒子S、P、Nで表される(図4A 右)。静電相互作用とvdW相互作用は、異なるチェーン間で考慮されます。CGシミュレーションにおけるタンパク質とDNA間の静電相互作用は、デバイ・ヒュッケル電位55によって近似される。vdWの反発エネルギーは囲碁モデルと同じ形をとります。
    5. md_informationブロック(必須)を設定してシミュレーション情報を定義します。次のコマンドを入力します。
      <<<< md_information
      n_step_sim = 1
      n_tstep(1) = 500000000
      tstep_size = 0.1
      n_step_save = 1000
      n_step_neighbor = 100
      i_com_zeroing = 0
      i_no_trans_rot = 0
      テンプ = 300.0
      n_seed = -1
      >>>>
      n_tstepはシミュレーションステップです。各MDステップの時間長としてtstep_sizeを設定し、各CGカフェモールの時間ステップは約200 fs30なので、ここでの各MDステップは原則として200×0.1 fsです。100 MD ステップごとに近隣リストを更新します (n_step_neighbor = 100)。シミュレーション温度を300Kに設定し、速度型Verletアルゴリズムを採用して温度を制御し、ベレンセンサーモスタット56でタンパク質構造を更新します。
      注: n_step_simは、囲碁モデルベースのポテンシャルの流域番号、またはエネルギー曲線のローカル最小数です。複数の流域ポテンシャルは、タンパク質立体構造が異なる立体構造に偏ることを可能にするので、タンパク質立体構造はある局所最小値から別の極小値に変化することができる。ここでは、単一の流域囲碁モデルのみが使用され、シミュレーションにおけるタンパク質の偏った立体構造(結晶構造)は1つだけを意味する。一方、CGの文脈でモデル化されたタンパク質-DNA水素結合相互作用などがないため、分子運動は原子シミュレーションよりもさらに高速、すなわち>10倍サンプリングすることができます。
    6. 静電相互作用が異なるチェーン間で考慮されるように静電ブロック(静電相互作用が使用されている場合にのみ必要)を設定するので、このブロックを使用して、次のように入力して静電相互作用のパラメータを定義します。
      静電<<<<
      cutoff_ele = 10.0
      ionic_strength = 0.15
      >>>>
      静電相互作用における Debye 長を 10 Å に設定し、解条件に対応します。生理学的条件と同様に、イオン強度を0.15 Mに設定してください。

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Representative Results

回転結合摺動またはMSM構造からのWRKYの1 bpステッピング
DNA上のすべてのタンパク質立体構造は、DNAに沿ったタンパク質COMの縦方向運動Xおよび回転角度にマッピングされる( 図3A参照)。これら2度の直線結合は、DNA上のWRKYドメインタンパク質の回転結合ステッピングを示す。立体構造は、MSM の 3 つのマクロ状態 (S1、S2、および S3) にさらにクラスター化できます。WRKYのフォワードステッピングは、マクロ状態遷移S1->S2->S3に続く。S1は、モデル化された構造(WRKY−DNA複合体40の結晶構造に基づく)によって開始される準安定状態を指し、〜6%の集団を有する。なお、現在のモデリングでは、タンパク質が特異的なW-box DNA配列40と結合する結晶構造から、初期のタンパク質立体構造を採用した。したがって、このようなモデル化されたタンパク質-ポリA-DNA複合体は、階段状または最終的に緩和された構造(S3)よりも好ましい初期構造(S1)を生じさせる。それにもかかわらず、タンパク質-DNA界面の水素結合(HB)は、S1の中心付近と同様にS3の中心付近で回復することがわかる( 図3B参照)。S1 状態の HB は、A15 の K125、A16 の R131、Q146、Y133 と A16、K144 と Y119 の A17、R135 と A18 の順に維持されています (図 3B 左上)。S3は、1-bpタンパク質ステッピング後の準安定状態を指し、ほとんどすべてのHBが1-bp距離だけシフトし(図3B 下段)、構造は最も高い集団(63%)で安定に見える。中間状態S2は、S1とS3を接続し、中〜高母集団(〜30%)を有する。R135とK144は、この中間状態では非常に柔軟であり、通常、現在のヌクレオチドでHBを壊し、次のヌクレオチドでそれを改革できることがわかった(図3B 右上)。全体として、WRKYタンパク質COMは〜2.9Å移動し、ここで1bpをステッピングするために〜55°回転した。WRKYステッピングの律速ステップはS2->S3で、本質的にHBの集団的な破壊と改質を可能にし、平均で約7μsを必要とします。対照的に、S1〜S2は、主にタンパク質COM変動(例えば、DNA上のタンパク質配向変化による)を伴う、〜0.06μsまたは60nsの時間で非常に速く通過することができる(図3B)。

CGモデルにおけるプロセス拡散時のWRKYの一本鎖バイアス
我々の最近の研究では、WRKYドメインタンパク質が、1-bpステッピング中または静的結合中に関係なく、dsDNAの1本の鎖に優先的に結合することを見出した。そして、一本鎖バイアスは、特に特異的DNA配列結合時に非常に顕著になる8。一方、このような傾向がDNAに沿ったタンパク質のプロセス的拡散中に残るかどうかは明らかではない。ここでは、CGシミュレーション による 潜在的なストランドバイアスを調べようとしました。興味深いことに、重要な一本鎖DNA結合構成が、プロセス拡散中のWRKYのCGシミュレーションにおいて同定されている。それを見るために、タンパク質とDNAとの間の接触数を、それぞれのDNA鎖上で計算した( 図4B参照)。タンパク質CG粒子とDNA CG P(リン酸基)粒子との間の距離が7Åより小さい場合、接触が考慮される。タンパク質は、DNA鎖の1つにバイアス(例えば、一方の鎖に〜4回の接触、他方の鎖に〜1回の接触)を示す、すなわち、タンパク質−DNA界面におけるHBなどの詳細な相互作用がモデル化されていない場合でさえ、実際に示す。

しかしながら、好ましいDNA鎖は、DNA上のタンパク質の結合配向または配置に応じて、DNAの2つの鎖間で時々切り替えることができる。特に、タンパク質とDNAの各鎖との間に形成される接触数によれば、ここでは主に4つの状態が存在する( 図4B、Cの1、2、3、および4とラベル付けされている)。状態1および3において、亜鉛フィンガー領域は-Y方向に向かって結合し、好ましい鎖は青色のものである。状態2、3では、亜鉛・フィンガー領域が+Y方向に向かって結合し、好ましい鎖が赤色のものとなる。また、亜鉛-フィグナー領域がDNAと優勢に相互作用することも判明している( 図4D参照)。したがって、亜鉛 - フィンガー領域と密接に結合したDNA鎖は確かに好ましいものである。上記のサンプリングによれば、したがって、鎖バイアスは持続するが、プロセスタンパク質拡散のCGモデルにおいて2つのDNA鎖の間で切り替わるように見える。

CGシミュレーションにおけるタンパク質個々の残留ステッピング
我々のCGシミュレーションから、WRKYのステッピングサイズはDNA配列によって異なる可能性があることが以前に認識されていた8。タンパク質COMは、均質なポリADNA上で1bpのステップを行う傾向がある。2 bpの周期性を有するポリATDNAでは、2-bpのステッピングの割合が増加するようである。

さらに、ここでは、個々のタンパク質残基がタンパク質-DNA界面で同期的に移動するかどうかを調べた。我々は、1000時間ステップごとにWRKYモチーフ(WRKYGQK)内の高度に保存された各残基のステッピングサイズを計算した(図5A)。したがって、保存された各残留物の残留ステッピングサイズは、CGシミュレーションから測定することができる。この結果は、これらの個々の残基のステッピングサイズが、ポリATまたはランダムDNA配列よりもポリA DNA上でより同期していることを示しています(図5B)。

Figure 1
図1:立体構造生成とミクロステート/マクロステートの構築。 (A)タンパク質-DNA RMSDとDNA周りのタンパク質回転角度にマッピングされた初期順方向ステッピング経路。最初に選択された25の構造は、赤い円でラベル付けされています。(B) 第1ラウンドの 25 x 50 ns MDシミュレーション軌道からの100個の立体構造クラスター中心を、2つの最も高い固有値tICs方向にマッピングする。(C)選択された距離ペアを入力として使用して、tICA による MSM構築のラグタイムの関数として暗黙のタイムスケールをプロットする。各セットについて、MSMは、上位2つのtICに立体構造を投影し、続いてK中心クラスタリングを行い、5~40ns(上段から下段)から選択されたtICAの相関遅延時間で20~2000個のマイクロステート(左から右の列)を生成することによって構築されました。(D)500個のマイクロステートが構築され、(E)さらに構築された3つのマクロステートは、対応するマイクロステート中心が最高2つのtIC方向に沿ってマッピングされる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:マクロステートの構築 。(A)DNA長軸(X)とDNA周りの回転角度に沿ったタンパク質質量中心(COM)移動(左)上の初期順方向ステッピング経路軌道(左)と少数の追加のマイクロ秒軌道サンプリング(右)のマッピング(以前に8)。(B) 現在のMSM建設で使用されている元の100 × 50 ns軌道と97 × 50 ns軌道のマッピング。(C) 構築されたMSMからの3-6個のマクロステートの構築とその集団は、広範なサンプリングマップ上にラベル付けされている。(d)DNAを中心とするタンパク質運動Xおよび回転角度をそれぞれ示す。サンプリングされた立体構造は最終的に 3 つのマクロ状態にまとめられ、赤、青、および灰色はマクロ状態 1、2、および 3 に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ポリA DNAを踏むWRKYドメインタンパク質のMSM。 (A)DNAに対するタンパク質COM運動Xおよび回転角度の座標へのMD立体構造スナップショットの投影。3 つのマクロ状態 S1、S2、および S3 は、それぞれ赤、青、および灰色で色付けされています。(B)構築された3つのマクロ状態の代表的な立体構造と遷移平均第1継代時間(MFPT)。タンパク質とDNAの間の重要な水素結合が示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:粗粒度(CG)モデルと、CGモデルにおけるタンパク質鎖とDNA鎖の間に形成された接触。 (A)タンパク質(左)とDNAの粗粒化(右)。(B)シミュレーションに沿ったWRKYと各DNA鎖との接触数。(c)4つの接触モードの分子図。亜鉛指の近くのタンパク質領域は灰色で着色され、他の領域は緑色で着色される。(d)各タンパク質アミノ酸とDNAとの接触確率。アミノ酸と任意のDNAのCG粒子とのCG粒子間の距離が7Åより小さい場合、アミノ酸はDNAと接触していると考えられる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:WRKYモチーフ中の個々のタンパク質アミノ酸の拡散ステップサイズは、DNAに沿って移動するWRKYとして、 (A)原子構造(左)および粗粒化後(右)の高度に保存された残基(WRKYGQK)である。(B) DNAの異なる配列(ポリA;ポリ-AT;ランダム配列)上の各保存残基のステッピングサイズ は、この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。

補足ファイル1: このプロトコルで使用される Python コードとソフトウェア。MSMは主にMSMbuilderを使用して構築され、必要なPythonコードが添付されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2: 原子論的分子動力学シミュレーションはGROMACSによって行われ、全原子シミュレーションを構築するためのコマンドと必要なファイルも添付されています。粗粒度のシミュレーションは、CafeMolのソフトウェアによって行われます。シミュレーション結果はVMDとMATLABによって解析されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3: VMD 内のタンパク質を回転および移動させるための tcl スクリプト。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本研究は、構造ベースの計算シミュレーションとサンプリングを行い、DNAに沿って移動する転写因子またはTFタンパク質を、ステッピングの原子詳細だけでなく、DNA標的探索におけるTFの促進拡散に不可欠なプロセス拡散においても明らかにする方法に取り組む。そのために、均質なポリA DNAに沿って1-bpの小さなTFドメインタンパク質WRKYステッピングのマルコフ状態モデルまたはMSMが最初に構築され、タンパク質-DNA界面における集合水素結合またはHBダイナミクスとともにDNA上のタンパク質立体構造のアンサンブルが明らかにされ得る。MSMを得るために、我々は7.5μs(125 x 60ns)の凝集における電流サンプリングで、自発的なタンパク質ステッピング経路(以前の10μsシミュレーションから得られた)に沿って2ラウンドの広範な全原子MDシミュレーションを実施した。このような広範なサンプリングは、タンパク質-DNA界面対距離をクラスタリングの幾何学的尺度として利用して、数百の微小状態への立体構造クラスタリングのためのスナップショットを提供します。MSM構造のマルコフ特性は、個々のMDシミュレーションのさまざまな長さまたはラグタイムに対して計算された暗黙のタイムスケールからの時間スケールの分離を検出することによって部分的に検証されます。次に、20~2000個のマイクロステートを時間スケールの分離特性について試験および比較し、MSM構築用に500個のマイクロステートを選択した。さらに、500個のマイクロステートは運動学的に少数のマクロステートにまとめられており、そのために様々な数の状態をテストし、現在のシステムには3つのマクロステートで十分であることがわかりました。3状態モデルは、状態S1がDNA上のタンパク質質量中心(COM)変動によって支配される比較的速く(数十ns以内に)S2にトランジットする一方で、状態S2がS3にゆっくりとトランジットし、律速(平均で〜7μs)であり、ステッピングのための集合HBダイナミクスによって支配されることを示している。微小状態を少数の運動学的に異なるマクロ状態にまとめることは、依然として方法論的発展の対象であり、異なるアルゴリズムがテストされ、改善のための機械学習技術57,58,59,60,61,62,63.MSMを構築するための重要なステップには、tICAで使用される距離ペアの選択と、マイクロステートの構築に使用されるパラメータの決定が含まれます。距離ペアの選択は知識ベースであり、最も重要な相互作用ペアを選択することが重要です。相関遅延時間、ラグタイム、マイクロステートのミューバーなどのマイクロステートを構築するためのパラメータは、システムがマルコビアンであることを保証するために適切に設定する必要があります。

このような努力により、DNAに沿って1-bpのタンパク質ステッピングについて、原子の詳細を持つサブマイクロからマイクロ秒のタンパク質構造ダイナミクスを体系的に明らかにすることができる。原理的には、MSM構築から得られた遷移確率行列を用いて、システムはマイクロ秒を超えて、またはミリ秒以上および13,17,64以上に近づくように、長い時間スケールに進化させることができる。しかし、MSMのサンプリングと構築には本質的な制限があり、特定の初期パスの周りのサブマイクロ秒の個々のシミュレーションに依存しており、マルコフのプロパティは65,66十分に保証されていない可能性があります。ほとんどのプラクティスでは、初期経路は強制または加速の下で構築されましたが、現在のシステムでは、10msの平衡シミュレーションから得られた自発的なタンパク質ステッピング経路(強制または加速なし)を利用します8。集合体の立体構造サンプリングは、原子シミュレーションの計算コストが高いため、依然として数十マイクロ秒に制限されています。タンパク質ステッピングのこのようなマイクロ秒サンプリングは、長時間スケールのプロセス的TF拡散に現れるのに十分な立体構造を提供する可能性は低い。現在取得されている遷移確率行列を特定の時間スケールを超えて実装すると、メモリの問題が重要になり、マルコフプロパティが現在のMSM 14,52,66の適切な使用を保証することは保証されません。したがって、DNAに沿ったTFの長時間スケールのプロセス拡散をサンプリングするために、残基レベルの粗粒化またはCGモデリングおよびシミュレーションが代わりに実装され、構造的基礎を維持することと計算コストを低下させることとの間のバランスをとる。

CGモデリングおよびシミュレーションにおいて、タンパク質残基およびDNAヌクレオチドはビーズ(すなわち、1つのアミノ酸に対して1つのビーズ、および1つのヌクレオチドに対して3つのビーズ)によって表され、タンパク質の立体構造は、Goモデルを介して天然または予め平衡化された構成30,53に向かって維持される。HB相互作用の原子レベルはCGモデルには存在しないが、タンパク質-DNA静電相互作用はよく維持されており、DNA 67、68、69、70に沿ったタンパク質のプロセス拡散における支配的なダイナミクスの特徴を捉えることができるようである。ここでは、WRKY-DNAシステムのモデリングとシミュレーションのための詳細な実装プロトコルを紹介します。代表的な結果は、まず、WRKY-DNAシステムの以前の原子シミュレーションで提示された一本鎖DNAバイアスがCGモデルに持続する一方で、プロセス拡散中にサンプリングされた様々なタンパク質の配向/配置が、2つの鎖間のバイアスの時々の切り替えにつながることを興味深いものに示している。したがって、このようなDNA鎖バイアスは必ずしもHB会合と関連しているわけではなく、主にタンパク質-DNA静電相互作用に依存しているようであり、これはDNA上の様々なタンパク質配置または配向によって異なる。次に、高度に保存されたWRKQGQKモチーフなど、タンパク質-DNA界面またはその近傍の個々のアミノ酸は、異なるDNA配列に対して異なるステッピングサイズまたは同期パターンを示す。我々の以前の研究では、タンパク質が異なるDNA配列に沿って拡散するようにモデル化されているため、ステッピングサイズの変動はタンパク質のCOMについてのみ示された。DNAの現在のCGモデルは、異なるパラメータ化54,71,72を有するDNA配列変異をサポートしているが、原子の詳細は欠落していることに注意してください。したがって、タンパク質-DNA系の構造ベースのモデリングにおける適切なDNA配列依存性パラメータ化は、複数の時間および長さスケールにわたるタンパク質-DNA検索および認識メカニズムを明らかにするために重要である。

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Disclosures

著者には利益相反はありません。

Acknowledgments

この作業は NSFC Grant #11775016 と #11635002 によってサポートされています。JYは、NSF DMS 1763272とサイモンズ財団助成金#594598およびUCIからのスタートアップ基金を通じて、UCIのCMCFによって支援されています。LTDは、上海#20ZR1425400#21JC1403100の自然科学財団の支援を受けています。我々はまた、北京計算科学研究センター(CSRC)からの計算支援を認識する。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CafeMol Kyoto University coarse-grained (CG) simulations
GROMACS University of Groningen Royal Institute of Technology Uppsala University molecular dynamics simulations software
Matlab MathWorks Numerical calculation software
MSMbuilder Stanford University build MSM
VMD UNIVERSITY OF ILLINOIS AT URBANA-CHAMPAIGN molecular visualization program

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生物学 第181号
原子スケールのステッピングから粗粒拡散までのDNAに沿った転写因子タンパク質移動の構造ベースのシミュレーションとサンプリング
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E, C., Dai, L., Tian, J., Da, L. T., … More

E, C., Dai, L., Tian, J., Da, L. T., Yu, J. Structure-Based Simulation and Sampling of Transcription Factor Protein Movements along DNA from Atomic-Scale Stepping to Coarse-Grained Diffusion. J. Vis. Exp. (181), e63406, doi:10.3791/63406 (2022).

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