Bioprospektering av extremofile mikroorganismer for å håndtere miljøforurensning
Summary
Isolering av tungmetallresistente mikrober fra geotermiske fjærer er et hett tema for utvikling av bioremediering og miljøovervåking av biosystemer. Denne studien gir en metodisk tilnærming for å isolere og identifisere tungmetalltolerante bakterier fra varme kilder.
Abstract
Geotermiske kilder er rike på ulike metallioner på grunn av samspillet mellom stein og vann som foregår i den dype akviferen. Videre, på grunn av sesongvariasjon i pH og temperatur, observeres svingninger i elementsammensetning periodisk i disse ekstreme miljøene, og påvirker de miljømessige mikrobielle samfunnene. Extremophilic mikroorganismer som trives i vulkanske termiske ventiler har utviklet motstandsmekanismer for å håndtere flere metallioner som er tilstede i miljøet, og dermed ta del i komplekse metallbiogeokjemiske sykluser. Videre har ekstrememofile og deres produkter funnet et omfattende fotfeste i markedet, og dette gjelder spesielt for deres enzymer. I denne sammenhengen er karakteriseringen funksjonell for utvikling av biosystemer og bioprosesser for miljøovervåking og bioremediering. Til dags dato representerer isolasjon og dyrking under laboratorieforhold av ekstremofile mikroorganismer fortsatt en flaskehals for fullt ut å utnytte sitt bioteknologiske potensial. Dette arbeidet beskriver en strømlinjeformet protokoll for isolering av termofile mikroorganismer fra varme kilder samt deres genotypiske og fenotypiske identifikasjon gjennom følgende trinn: (1) Prøvetaking av mikroorganismer fra geotermiske steder (“Pisciarelli”, et vulkansk område av Campi Flegrei i Napoli, Italia); (2) Isolering av tungmetallresistente mikroorganismer; (3) Identifisering av mikrobielle isolasjoner; (4) Fenotypisk karakterisering av isolasjonene. Metodene beskrevet i dette arbeidet kan generelt brukes også for isolering av mikroorganismer fra andre ekstreme miljøer.
Introduction
De ekstreme miljøene på planeten vår er utmerkede kilder til mikroorganismer som er i stand til å tolerere tøffe forhold (dvs. temperatur, pH, saltholdighet, trykk og tungmetaller)1,2, er Island, Italia, USA, New Zealand, Japan, Sentral-Afrika og India, de best anerkjente og studerte vulkanske områdene 3,4,5,6,7,8,9 . Termofile har utviklet seg i tøffe miljøer i en rekke temperaturer fra 45 °C til 80 °C 10,11,12. Termofile mikroorganismer, enten som tilhører de arkaeale eller bakterielle kongedømmene, er et reservoar for studiet av biologisk mangfold, fylogenesis og produksjon av eksklusive biomolekyler for industrielle applikasjoner 13,14,15,16. Faktisk har den kontinuerlige industrielle etterspørselen i det globale markedet i de siste tiårene oppmuntret til utnyttelse av ekstreme og termozymer for sine diversifiserte applikasjoner i flere bioteknologiske felt 17,18,19.
Varme kilder, hvor organismer lever i konsortier, er rike kilder til biologisk mangfold, og representerer dermed et attraktivt habitat for å studere mikrobiell økologi20,21. Videre koloniseres disse vulkanske metallrike områdene ofte av mikroorganismer som har utviklet toleransesystemer for å overleve og tilpasse seg tilstedeværelsen av tungmetaller22,23 og er derfor aktivt involvert i deres biogeokjemiske sykluser. I dag anses tungmetaller som prioriterte miljøgifter for mennesker og miljø. De tungmetallresistente mikroorganismer er i stand til å løse og utfelle metaller ved å transformere dem og ombygge økosystemene sine24,25. Forståelsen av de molekylære mekanismene for tungmetallresistens er et hett tema for å utvikle nye grønne tilnærminger 26,27,28. I denne sammenhengen representerer oppdagelsen av nye tolerante bakterier utgangspunktet for å utvikle nye strategier for miljøbioremediering24,29. I samarbeid med arbeidet med å utforske hydrotermale miljøer gjennom mikrobiologiske prosedyrer og øke kunnskapen om genets rolle(er) som understøtter tungmetalltoleranse, ble det gjennomført en mikrobiell screening i varme kilder i Campi Flegrei i Italia. Dette tungmetallrike miljøet viser en kraftig hydrotermisk aktivitet, fumarol og kokende bassenger, variabel i pH og temperatur i avhengighet av sesongmessighet, nedbør og underjordiske geologiske bevegelser30. I dette perspektivet beskriver vi en lett anvendelig og effektiv måte å isolere bakterier som er resistente mot tungmetaller, for eksempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (navngitt som isolat 1) og Alicyclobacillus mali FL1832 (navngitt som isolat 2) fra Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varme kilder inneholder et uutnyttet mangfold av mikrobiomer med like variert metabolsk kapasitet12. Utviklingen av strategier for isolering av mikroorganismer som effektivt kan konvertere tungmetaller til mindre giftige forbindelser10 representerer et forskningsområde av økende interesse over hele verden. Dette dokumentet tar sikte på å beskrive en strømlinjeformet tilnærming for screening og isolering av mikrober med evnen til å motstå giftige kjemikalier. Metoden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 og av GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Vi takker Dr. Monica Piochi og Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) for identifisering og karakterisering av geotermisk sted.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
