JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Çevre Kirliliğini Ele Almak için Ekstremofilik Mikroorganizmaların Biyoprospektifi

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

Ağır metale dayanıklı mikropların jeotermal kaynaklardan izole edilmesi, biyoremediasyon ve çevresel izleme biyosistemlerinin geliştirilmesi için sıcak bir konudur. Bu çalışma, kaplıcalardan ağır metal toleranslı bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması için metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.

Abstract

Jeotermal kaynaklar, derin akiferde meydana gelen kaya ve su arasındaki etkileşim nedeniyle çeşitli metal iyonları bakımından zengindir. Ayrıca, pH ve sıcaklıktaki mevsimsellik değişimi nedeniyle, bu aşırı ortamlarda element bileşimindeki dalgalanma periyodik olarak gözlenir ve çevresel mikrobiyal toplulukları etkiler. Volkanik termal menfezlerde gelişen ekstremofilik mikroorganizmalar, çevrede bulunan birkaç metal iyonunu işlemek için direnç mekanizmaları geliştirmiş ve böylece karmaşık metal biyojeokimyasal döngülerine katılmışlardır. Dahası, ekstremofiller ve ürünleri pazarda geniş bir dayanak noktası bulmuşlardır ve bu özellikle enzimleri için geçerlidir. Bu bağlamda, karakterizasyonları, çevresel izleme ve biyoremediasyon için biyosistemlerin ve biyosüreçlerin geliştirilmesinde işlevseldir. Bugüne kadar, ekstremofilik mikroorganizmaların laboratuvar koşullarında izolasyonu ve yetiştirilmesi, biyoteknolojik potansiyellerini tam olarak kullanmak için hala bir darboğazı temsil etmektedir. Bu çalışma, termofilik mikroorganizmaların kaplıcalardan izole edilmesinin yanı sıra genotipik ve fenotipik tanımlamaları için aşağıdaki adımlarla kolaylaştırılmış bir protokolü açıklamaktadır: (1) Jeotermal bölgelerden mikroorganizmaların örneklenmesi (“Pisciarelli”, Napoli, İtalya’daki Campi Flegrei’nin volkanik bir alanı); (2) Ağır metal dirençli mikroorganizmaların izolasyonu; (3) Mikrobiyal izolatların tanımlanması; (4) İzolatların fenotipik karakterizasyonu. Bu çalışmada açıklanan metodolojiler genellikle mikroorganizmaların diğer aşırı ortamlardan izolasyonu için de uygulanabilir.

Introduction

Gezegenimizdeki aşırı ortamlar, sert koşulları (yani sıcaklık, pH, tuzluluk, basınç ve ağır metalleri) tolere edebilen mükemmel mikroorganizma kaynaklarıdır1,2, İzlanda, İtalya, ABD, Yeni Zelanda, Japonya, Orta Afrika ve Hindistan, en iyi tanınan ve çalışılan volkanik alanlar 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiller zorlu ortamlarda 45 °C ila 80 °C 10,11,12 arasındaki sıcaklıklarda evrimleşmiştir. Arkeal veya bakteri krallıklarına ait termofilik mikroorganizmalar, biyoçeşitliliğin, filogenezin incelenmesi ve endüstriyel uygulamalar için özel biyomoleküllerin üretimi için bir rezervuardır 13,14,15,16. Gerçekten de, son yıllarda, küresel pazardaki sürekli endüstriyel talep, ekstremofillerin ve termozimlerin çeşitli biyoteknolojik alanlardaki çeşitlendirilmiş uygulamaları için sömürülmesini teşvik etmiştir 17,18,19.

Organizmaların konsorsiyumlarda yaşadığı kaplıcalar, zengin biyolojik çeşitlilik kaynaklarıdır, bu nedenle mikrobiyal ekolojiyi incelemek için çekici bir yaşam alanını temsil eder20,21. Dahası, bu volkanik metal bakımından zengin alanlar, hayatta kalmak ve ağır metallerin varlığına uyum sağlamak için tolerans sistemleri geliştiren mikroorganizmalar tarafından yaygın olarak kolonize edilir22,23 ve bu nedenle biyojeokimyasal döngülerine aktif olarak katılırlar. Günümüzde, ağır metaller insanlar ve çevre için öncelikli kirleticiler olarak kabul edilmektedir. Ağır metale dirençli mikroorganizmalar, metalleri dönüştürerek ve ekosistemlerini yeniden şekillendirerek çözündürebilir ve çökeltebilir24,25. Ağır metal direncinin moleküler mekanizmalarının anlaşılması, yeni yeşil yaklaşımların geliştirilmesinin aciliyeti için sıcak bir konudur26,27,28. Bu bağlamda, yeni toleranslı bakterilerin keşfi, çevresel biyoremediasyon için yeni stratejiler geliştirmenin başlangıç noktasını temsil etmektedir24,29. Mikrobiyolojik prosedürler yoluyla hidrotermal ortamları keşfetme ve ağır metal toleransını destekleyen gen (ler) in rolü hakkındaki bilgileri artırma çabalarına eşlik ederken, İtalya’daki Campi Flegrei’nin kaplıca bölgesinde mikrobiyal bir tarama yapıldı. Bu ağır metal bakımından zengin ortam, mevsimsellik, yağış ve yeraltı jeolojik hareketlerine bağlı olarak pH ve sıcaklıkta değişken olan güçlü bir hidrotermal aktivite, fumarol ve kaynar havuzlar gösterir30. Bu perspektifte, Campi Flegrei’nin Pisciarelli bölgesinden Geobacillus stearothermophilus GF16 31 (izolat 1 olarak adlandırılır) ve Alicyclobacillus mali FL1832 (izolat2 olarak adlandırılır) gibi ağır metallere dirençli bakterileri izole etmenin uygulaması kolay ve etkili bir yolunu açıklıyoruz.

Protocol

1. Jeotermal alanlardan mikroorganizmaların örneklenmesi İstenilen sıcaklık ve pH’a sahip yerleri kriter olarak kullanarak örnekleme için yeri seçin. Fiziksel parametreleri, seçilen havuzlara veya çamurlara yerleştirerek dijital bir termokupl probu ile ölçün. 20 g toprak örneği toplayın (bu durumda, Pisciarelli Solfatara’nın hidrotermal bölgesindeki çamurdan), sterilize edilmiş bir kaşıkla toplayın. Seçilen her site için en az iki örnek alın. Numu…

Representative Results

Örnekleme sitesiBu protokol, ağır metale dirençli bakterilerin bir kaplıcadan izole edilmesi için bir yöntem göstermektedir. Bu çalışmada örnekleme alanı olarak asit-sülfidik jeotermal ortam olan Pisciarelli alanı kullanılmıştır (Şekil 1). Bu ekosistem, volkanik faaliyetlerden türetilen agresif kükürtlü sıvıların akışı ile karakterizedir. Asit-sülfidik jeotermal sistemlerdeki mikrobiyal toplulukların, yüksek konsantrasyon…

Discussion

Kaplıcalar, eşit derecede çeşitli metabolik kapasitelere sahip kullanılmayan mikrobiyom çeşitliliği içerir12. Ağır metalleri daha az toksik bileşiklere verimli bir şekilde dönüştürebilen mikroorganizmaların izolasyonu için stratejilerin geliştirilmesi10, dünya çapında artan ilgi alanına sahip bir araştırma alanını temsil etmektedir. Bu yazıda, toksik kimyasallara direnme kabiliyetine sahip mikropların taranması ve izolasyonu için kolaylaştı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amiloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 ve GoodbyWaste: Obtain GoodbyWaste: Obtain GOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, İtalya tarafından desteklenmiştir. Jeotermal alanın tanımlanması ve karakterizasyonu için Dr. Monica Piochi ve Dr. Angela Mormone’ye (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, İtalya) teşekkür ederiz.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

Tags

Keywords: BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer
check_url/63453?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image