Bioprospektering av extremofila mikroorganismer för att ta itu med miljöföroreningar
Summary
Isoleringen av tungmetallresistenta mikrober från geotermiska källor är ett hett ämne för utvecklingen av bioremediering och miljöövervakning biosystem. Denna studie ger ett metodologiskt tillvägagångssätt för att isolera och identifiera tungmetalltoleranta bakterier från varma källor.
Abstract
Geotermiska fjädrar är rika på olika metalljoner på grund av samspelet mellan sten och vatten som äger rum i den djupa akvifern. Dessutom, på grund av säsongsvariation i pH och temperatur, observeras fluktuationer i elementkompositionen periodiskt inom dessa extrema miljöer, vilket påverkar de miljömässiga mikrobiella samhällena. Extremofila mikroorganismer som trivs i vulkaniska termiska ventiler har utvecklat resistensmekanismer för att hantera flera metalljoner som finns i miljön och därmed delta i komplexa metallbiogeokemiska cykler. Dessutom har extremofiler och deras produkter fått ett omfattande fotfäste på marknaden, och detta gäller särskilt för deras enzymer. I detta sammanhang är deras karakterisering funktionell för utvecklingen av biosystem och bioprocesser för miljöövervakning och bioremediering. Hittills utgör isoleringen och odlingen under laboratorieförhållanden av extremofila mikroorganismer fortfarande en flaskhals för att fullt ut utnyttja deras biotekniska potential. Detta arbete beskriver ett strömlinjeformat protokoll för isolering av termofila mikroorganismer från varma källor samt deras genotypiska och fenotypiska identifiering genom följande steg: (1) Provtagning av mikroorganismer från geotermiska platser (“Pisciarelli”, ett vulkaniskt område i Campi Flegrei i Neapel, Italien); (2) Isolering av tungmetallresistenta mikroorganismer. (3) Identifiering av mikrobiella isolat. (4) Fenotypisk karakterisering av isolaten. De metoder som beskrivs i detta arbete kan generellt tillämpas även för isolering av mikroorganismer från andra extrema miljöer.
Introduction
De extrema miljöerna på vår planet är utmärkta källor till mikroorganismer som kan tolerera svåra förhållanden (dvs. temperatur, pH, salthalt, tryck och tungmetaller)1,2, som är Island, Italien, USA, Nya Zeeland, Japan, Centralafrika och Indien, de mest erkända och studerade vulkaniska områdena 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiler har utvecklats i tuffa miljöer i ett temperaturintervall från 45 ° C till 80 ° C 10,11,12. Termofila mikroorganismer, som antingen tillhör arkeala eller bakteriella riken, är en reservoar för studier av biologisk mångfald, fylogenes och produktion av exklusiva biomolekyler för industriella tillämpningar 13,14,15,16. Faktum är att under de senaste decennierna har den kontinuerliga industriella efterfrågan på den globala marknaden uppmuntrat utnyttjandet av extremofiler och termozymer för deras diversifierade tillämpningar inom flera biotekniska områden 17,18,19.
Varma källor, där organismer lever i konsortier, är rika källor till biologisk mångfald, vilket representerar en attraktiv livsmiljö för att studera mikrobiell ekologi20,21. Dessutom koloniseras dessa vulkaniska metallrika områden vanligen av mikroorganismer som har utvecklat toleranssystem för att överleva och anpassa sig till närvaron av tungmetaller22,23 och är därför aktivt involverade i sina biogeokemiska cykler. Numera anses tungmetaller vara prioriterade föroreningar för människor och miljö. De tungmetallresistenta mikroorganismerna kan solubilisera och fälla ut metaller genom att omvandla dem och omforma sina ekosystem24,25. Förståelsen av de molekylära mekanismerna för tungmetallresistens är ett hett ämne för brådskan att utveckla nya gröna tillvägagångssätt 26,27,28. I detta sammanhang utgör upptäckten av nya toleranta bakterier utgångspunkten för att utveckla nya strategier för miljöbioremediering24,29. Som ett led i arbetet med att utforska hydrotermiska miljöer genom mikrobiologiska ingrepp och öka kunskapen om genens eller genernas roll som ligger till grund för tungmetalltoleransen genomfördes en mikrobiell screening i det varma källområdet Campi Flegrei i Italien. Denna tungmetallrika miljö visar en kraftfull hydrotermisk aktivitet, fumarol och kokande pooler, varierande i pH och temperatur beroende på säsongsmässighet, nederbörd och underjordiska geologiska rörelser30. I detta perspektiv beskriver vi ett lättanvänt och effektivt sätt att isolera bakterier som är resistenta mot tungmetaller, till exempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (namngiven som isolat 1) och Alicyclobacillus mali FL1832 (namngiven som isolat 2) från Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varma källor innehåller en outnyttjad mångfald av mikrobiom med lika olika metaboliska kapaciteter12. Utvecklingen av strategier för isolering av mikroorganismer som effektivt kan omvandla tungmetaller till mindre giftiga föreningar10 utgör ett forskningsområde av växande intresse över hela världen. Detta dokument syftar till att beskriva ett strömlinjeformat tillvägagångssätt för screening och isolering av mikrober med förmågan att motstå giftiga kemikali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 och av GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italien. Vi tackar Dr. Monica Piochi och Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italien) för identifiering och karakterisering av geotermisk plats.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
