טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה
Summary
פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.
Abstract
ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ”א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו – Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.
Introduction
ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה 1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA3. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע. זנים של המין הנימה Phormidium lacuna (איור 1) בודדו מבורות סלעים ימיים, שבהם התנאים הסביבתיים, כגון ריכוזי מלחים או טמפרטורה, משתנים עם הזמן. ציאנובקטריה נימה זו יכולה לשמש כאורגניזמים לדוגמה לסדר Oscillatoriales12 שאליו הם שייכים.
במהלך ניסויים שבדקו העברת גנים על ידי אלקטרופורציה13,14 נמצא כי P. lacuna יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית15. בתהליך זה, הדנ”א נקלט באופן טבעי על ידי תאים מסוימים. בהשוואה לשיטות אחרות של טרנספורמציה16,17, לטרנספורמציה טבעית יש יתרון בכך שאינה דורשת כלים נוספים שעלולים לסבך את ההליך. לדוגמה, אלקטרופורציה דורשת cuvettes תקין, חוטים שלמים, ובחירת המתח הנכון. P. lacuna הוא כיום חבר המתנדים היחיד הרגיש לטרנספורמציה טבעית. מכיוון שהפרוטוקול המקורי מבוסס על פרוטוקולי אלקטרופורציה, הוא עדיין כלל מספר שלבי כביסה שעשויים להיות מיותרים. גישות שונות נבדקו כדי לפשט את הפרוטוקול, מה שהוביל לפרוטוקול הטרנספורמציה שהוצג כאן.
רצף הגנום חיוני למחקרים מולקולריים נוספים המבוססים על נוקאאוט גנים או ביטוי יתר. למרות שניתן להשיג רצפי גנום עם מכונות ריצוף מהדור הבא תוך תקופות קצרות, מיצוי הדנ”א יכול להיות קשה ותלוי במין. עם P. lacuna נבדקו מספר פרוטוקולים. לאחר מכן הוקמה שיטה שונה המבוססת על צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), וכתוצאה מכך נוצרה טוהר מקובל של דנ”א ותפוקות DNA של כל מחזור טיהור להמשך העבודה במעבדה. ניתן לרצף את הגנום של חמישה זנים באמצעות פרוטוקול זה. שלב הטרנספורמציה ההגיונית הבא היה לבסס ביטוי חלבונים ב-P. lacuna.
ניתן לזהות את ה-sfGFP המשמש כחלבון סמן בפרוטוקול זה באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל היזמים שנבדקו יכלו לשמש לביטוי P. lacuna sfGFP. המספר ההולך וגדל של זנים הנובעים מטרנספורמציה הביא לצורך בשיטה לאחסון התרבויות. שיטות כאלה הוקמו עבור Escherichia coli וחיידקים רבים אחרים18. בפרוטוקולים סטנדרטיים, תרביות גליצרול מוכנות, מועברות בחנקן נוזלי ומאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שיטה זו דורשת רק כמה צעדים והיא אמינה מאוד עבור אותם מינים שעבורם היא הוקמה. הפרוטוקול הסטנדרטי לא היה אפשרי עבור P. lacuna מכיוון שלא ניתן היה לשחזר תאים חיים בכל המקרים. עם זאת, כאשר הגליצרול הוסר לאחר ההפשרה, תאים של כל הניסויים שרדו. שיטות פשוטות מוצגות לניתוח תנועתיות של P. lacuna, אשר ניתן לשלב עם מוטגנזה נוקאאוט כדי לחקור סוג IV pili או את התפקיד של photoreceptors. מבחנים אלה שונים מאלו של ציאנובקטריה חד-תאית 19,20,21 ויכולים להיות שימושיים גם עבור תנודות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי המכון הטכנולוגי של קרלסרוהר.
Materials
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
| Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
| Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
| Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
| Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Glassware, different | |||
| Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
| Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscope DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
| Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
| Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
| Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
| Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
| Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
| Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
| Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
| Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
| ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
| RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
| Culture media | |||
| Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
References
- Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
- Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
- Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
- Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
- Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
- Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
- Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
- Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
- Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
- Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
- Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).
- Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
- El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
- Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
- Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria – Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
- Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
- Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
- Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
- Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
- Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).
- Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
- Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -. P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
- French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).
- Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
- Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
- Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
- Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
- Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
- Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
- Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
- Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
- Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
- Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).
