Phormidium lacuna é um cianobacterium filamentoso que foi isolado de piscinas marinhas. Este artigo descreve o isolamento de filamentos de fontes naturais, extração de DNA, sequenciamento de genomas, transformação natural, expressão de sfGFP, crioconservação e motilidade.
As cianobactérias são o foco de pesquisas básicas e projetos biotecnológicos nos quais a energia solar é utilizada para a produção de biomassa. Phormidium lacuna é um recém-isolado cianobacterium filamentous. Este artigo descreve como novas cianobactérias filamentosas podem ser isoladas das piscinas marinhas. Também descreve como o DNA pode ser extraído de filamentos e como os genomas podem ser sequenciados. Embora a transformação seja estabelecida para muitas espécies unicelulares, é menos frequentemente relatada para cianobactérias filamentosas. Um método simplificado para a transformação natural de P. lacuna é descrito aqui. P. lacuna é o único membro da ordem Oscillatoriales para o qual a transformação natural é estabelecida. Este artigo também mostra como a transformação natural é usada para expressar proteína fluorescente verde superpatos (sfGFP). Um promotor endógeno do CPCB induziu aproximadamente 5 vezes mais expressão do que os promotores do CPC560, A2813 ou psbA2 do Synechocystis sp. PCC6803. Além disso, foi estabelecido um método para a criopreservação de P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803, e são descritos métodos para avaliação da motilidade em meio líquido e em superfícies de ágar e plástico.
Cianobactérias são organismos procarióticos que utilizam a fotossíntese como fonte de energia 1,2. A pesquisa está cada vez mais focada em espécies cianobacterianas. Várias cianobactérias podem ser transformadas com DNA3. Genes podem ser eliminados ou superexpressos nestas espécies. No entanto, a transformação é restrita a algumas espécies 4,5,6,7,8,9,10,11, e pode ser difícil estabelecer transformação em cepas de coleções culturais ou selvagens 8. Cepas da espécie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) foram isoladas de piscinas marinhas, nas quais as condições ambientais, como concentrações de sal ou temperatura, flutuam ao longo do tempo. Estas cianobactérias filamentosas podem ser usadas como organismos modelo para a ordem Oscillatoriales12 a que pertencem.
Durante os testes testando a transferência de genes por eletroporação13,14, descobriu-se que a P. lacuna pode ser transformada pela transformação natural15. Nesse processo, o DNA é tomado naturalmente por algumas células. Em comparação com outros métodos de transformação16,17, a transformação natural tem a vantagem de não exigir ferramentas adicionais que possam complicar o procedimento. Por exemplo, a eletroporação requer cuvetas adequadas, fios intactos e seleção da tensão adequada. P. lacuna é atualmente o único membro oscillatoriales suscetível à transformação natural. Como o protocolo original é baseado em protocolos de eletroporação, ele ainda incluía várias etapas de lavagem que podem ser desnecessárias. Diferentes abordagens foram testadas para simplificar o protocolo, levando ao protocolo de transformação aqui apresentado.
A sequência do genoma é essencial para outros estudos moleculares baseados em nocaute genético ou superexpressão. Embora as sequências de genoma possam ser obtidas com máquinas de sequenciamento de última geração em curtos períodos, a extração do DNA pode ser difícil e depende da espécie. Com P. lacuna, vários protocolos foram testados. Um método modificado de cetil trimethyl amônio (CTAB) foi então estabelecido, resultando em pureza aceitável dos rendimentos de DNA e DNA de cada ciclo de purificação para o trabalho contínuo em laboratório. O genoma de cinco cepas pode ser sequenciado com este protocolo. O próximo passo de transformação lógica foi estabelecer expressão proteica em P. lacuna.
O sfGFP usado como proteína marcadora neste protocolo pode ser detectado com qualquer microscópio de fluorescência. Todos os promotores que foram testados poderiam ser usados para a expressão P. lacuna sfGFP. O aumento do número de cepas decorrentes da transformação resultou na necessidade de um método para armazenar as culturas. Tais métodos são estabelecidos para Escherichia coli e muitas outras bactérias18. Nos protocolos padrão, culturas de glicerol são preparadas, transferidas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. Este método requer apenas alguns passos e é altamente confiável para as espécies para as quais é estabelecido. O protocolo padrão não era viável para P. lacuna porque as células vivas não podiam ser recuperadas em todos os casos. No entanto, quando o glicerol foi removido após o descongelamento, células de todos os ensaios sobreviveram. Métodos simples são apresentados para a análise da motilidade de P. lacuna, que pode ser combinada com mutagênese nocaute para investigar pili tipo IV ou o papel dos fotorreceptores. Estes ensaios são diferentes dos de cianobactériasunicelulares 19,20,21 e também podem ser úteis para outras Oscillatoria.
Embora muitas cepas de cianobactérias estejam disponíveis a partir de coleções culturais 32,33,34,35,36, ainda há uma demanda por novas cianobactérias da natureza porque essas espécies são adaptadas a propriedades específicas. P. lacuna foi coletado a partir de piscinas rochosas e é adaptado a variações de concentrações de sal e temperat…
The authors have nothing to disclose.
O trabalho contou com o apoio do Instituto de Tecnologia Karlsruher.
Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
Glassware, different | |||
Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
Microscope DM750 | Zeiss | ||
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
software, URL | |||
gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
Culture media | |||
Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |