لقد استخدمنا تقنيات الاستجابة السمعية القياسية لجذع الدماغ (ABR) وطبقناها على الدجاج المفرخ ، وهو نموذج طائر مبكر للوظيفة السمعية. يحدد البروتوكول إعداد الحيوانات وتقنيات الحصول على ABR بالتفصيل ، مع خطوات يمكن أن تترجم إلى نماذج أخرى للطيور أو القوارض.
استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) هي اختبار لا يقدر بثمن في علم السمع السريري ، والحيوانات غير البشرية ، والبحوث البشرية. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق ل ABRs في قياس التزامن العصبي السمعي وتقدير حساسية السمع في أنظمة نماذج الفقاريات الأخرى ، لم يتم الإبلاغ عن طرق لتسجيل ABRs في الدجاج منذ ما يقرب من أربعة عقود. يوفر الدجاج نموذجا قويا للبحوث الحيوانية لأن نظامه السمعي يقترب من النضج الوظيفي خلال مراحل الفراخ الجنينية المتأخرة والمبكرة. لقد أظهرنا الطرق المستخدمة للحصول على تسجيلات ABR ذات قناة واحدة أو قناتين باستخدام صفائف قطب الإبرة تحت الجلد في فراخ الدجاج. بغض النظر عن تكوين تسجيل القطب الكهربائي (أي المونتاج) ، تضمنت تسجيلات ABR 3-4 أشكال موجية ذروة إيجابية خلال أول 6 مللي ثانية من حافز النقر فوق العتبة. وتراوحت سعات الشكل الموجي من الذروة إلى القاع بين 2-11 ميكروفولت عند مستويات عالية الكثافة، مع ظهور قمم موجبة تظهر وظائف كثافة الكمون المتوقعة (أي الزيادة في الكمون كدالة لانخفاض الكثافة). كان وضع سماعة الأذن الموحد أمرا بالغ الأهمية للتسجيلات المثلى حيث يمكن للجلد المترهل أن يسد قناة الأذن ، ويمكن لحركة الحيوان أن تزيح محول التحفيز. كانت سعات الذروة أصغر ، وكانت فترات التأخير أطول مع انخفاض درجة حرارة جسم الحيوان ، مما يدعم الحاجة إلى الحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية. بالنسبة للفراخ الصغيرة (<3 ساعات بعد يوم الفقس 1) ، تم رفع العتبات بمقدار ~ 5 ديسيبل ، وزادت زمن انتقال الذروة ~ 1-2 مللي ثانية ، وانخفضت سعات الذروة إلى الحوض الصغير ~ 1 ميكروفولت مقارنة بالفقس الأكبر سنا. هذا يشير إلى وجود مشكلة محتملة متعلقة بالموصلية (أي سائل في تجويف الأذن الوسطى) ويجب مراعاته بالنسبة للصغار الصغار. بشكل عام ، تسمح طرق ABR الموضحة هنا بتسجيل دقيق وقابل للتكرار للوظيفة السمعية داخل الجسم الحي في فراخ الدجاج التي يمكن تطبيقها على مراحل مختلفة من التطور. يمكن مقارنة هذه النتائج بسهولة بالنماذج البشرية والثدييات لفقدان السمع أو الشيخوخة أو غيرها من التلاعب المرتبط بالسمع.
تعود دراسة الاستجابات العصبية المستحثة للمحفزات الصوتية إلى أكثر من نصف قرن1. استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) هي إمكانات مستحثة تم استخدامها كمقياس للوظيفة السمعية في كل من الحيوانات غير البشرية والبشر لعقود. يقدم ABR البشري من خمس إلى سبع قمم موجية الشكل تسمى تقليديا بالأرقام الرومانية (I-VII)2. يتم تحليل هذه القمم بناء على زمن الوصول (وقت حدوثها بالمللي ثانية) والسعة (حجم الذروة إلى الحوض الصغير بالميكروفولت) للاستجابات العصبية. يلعب ABR دورا أساسيا في تقييم وظيفة وسلامة العصب السمعي بالإضافة إلى حساسية جذع الدماغ وعتبة السمع. يؤدي العجز في الجهاز السمعي إلى غياب أو انخفاض أو إطالة أو عدم وجود زمن وصول أو سعة ABR. ومن اللافت للنظر أن هذه المعلمات متطابقة تقريبا في البشر والحيوانات الأخرى ، مما يجعلها اختبارا موضوعيا ثابتا للوظيفة السمعية عبر نماذج الفقاريات3.
أحد هذه الأنظمة النموذجية هو الدجاج ، وهو مفيد بشكل خاص لمجموعة متنوعة من الأسباب. يمكن تصنيف الطيور على أنها altricial أو precocial4. تفقس الطيور الثلاثية مع الحواس التي لا تزال تتطور. على سبيل المثال ، لا تظهر بوم الحظيرة ABR ثابتا حتى أربعة أيام بعد الفتحة5. الحيوانات المبكرة مثل الدجاج تفقس مع الحواس شبه الناضجة. تحدث بداية السمع في التطور الجنيني ، بحيث قبل أيام من الفقس (اليوم الجنيني 21) ، يكون الجهاز السمعي قريبا من النضج الوظيفي 6,7,8. الطيور الثلاثية ومعظم نماذج الثدييات عرضة للعوامل الخارجية التي تؤثر على التطور وتتطلب تربية الحيوانات حتى ينضج السمع. يمكن إجراء ABRs الدجاج في نفس يوم الفتحة ، مع التخلي عن الحاجة إلى التغذية أو بيئة مخصبة.
كان الدجاج الجنيني نموذجا مدروسا جيدا لعلم وظائف الأعضاء والتنمية ، خاصة في جذع الدماغ السمعي. وتشمل الهياكل المحددة نواة قوقعة الدجاج، مقسمة إلى نواة ماغنوسيلولاريس (NM) ونواة زاويريس (NA)، وارتباط الطيور للزيتون العلوي الإنسي المعروف باسم النواة الصفيحية (NL)6,7. يعد ABR مثاليا للتركيز على الوظيفة السمعية المركزية قبل مستوى الدماغ الأمامي والقشرة. توفر الترجمة بين قياسات ABR داخل الجسم الحي والدراسات العصبية في المختبر للتنمية8 وعلم وظائف الأعضاء9 و tonotopy 10 وعلم الوراثة11,12 فرصا بحثية مثالية تدعم دراسات الوظيفة السمعية الشاملة.
على الرغم من أن ABR قد تمت دراسته على نطاق واسع في نماذج الثدييات ، إلا أنه كان هناك تركيز أقل على الطيور. تشمل دراسات ABR السابقة للطيور توصيفات الببغاء 13 ونقار الخشب14 والنورس 15 وطيور الغوص 16 وعصفور الحمار الوحشي 17 والطيور الجارحة النهارية 18 والكناري 19 وثلاثة أنواع من البومة5،20،21،22 والدجاج23. بالنظر إلى ما يقرب من أربعة عقود منذ آخر توصيف شامل للدجاج ABR ، فقد تغيرت العديد من المعدات والتقنيات المستخدمة سابقا. يمكن أن تساعد الرؤى المستقاة من الدراسات التي أجريت على نماذج الطيور الأخرى في تطوير منهجية ABR الحديثة للدجاج بينما تعمل أيضا كمقارنة مع ABR الدجاج. ستحدد هذه الورقة الإعداد التجريبي والتصميم للسماح بتسجيل ABR في الدجاج المفرخ الذي يمكن تطبيقه أيضا على المراحل الجنينية من التطور وغيرها من نماذج القوارض الصغيرة والطيور. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى التطور المبكر للدجاج ، يمكن إجراء التلاعب التنموي دون أي تربية واسعة النطاق. يمكن تقييم التلاعب بالجنين النامي بعد ساعات قليلة فقط من فقس الحيوان بقدرات سمعية شبه ناضجة.
تمت دراسة جذع الدماغ السمعي للطيور بشكل جيد ، والعديد من الهياكل تشبه المسار السمعي للثدييات. يوفر العصب السمعي مدخلات مثيرة على النواتين المركزيتين من الدرجة الأولى، وهما النواة القوقعية ماغنوسيلولاريس (NM) والزاوي (NA). يرسل NM إسقاطا مثيرا ثنائيا إلى هدفه السمعي ، النواة الصفيحية (NL)7. مشاريع NL إلى نواة الدماغ المتوسط الجانبي ، pars dorsalis (MLd) 40,41. NL أيضا مشاريع إلى نواة أوليفاري متفوقة (SON) ، والتي توفر تثبيط التغذية المرتدة إلى NM و NA و NL42. يتم الحفاظ على هذه الدائرة الدقيقة السمعية السفلية لجذع الدماغ بشكل رائع للوظيفة التي تخدمها ، وتوطين الصوت ، والسمع بكلتا الأذنين33. تحتوي مناطق جذع الدماغ السمعية العليا للطائر أيضا على نوى مماثلة لل lemniscus الجانبي للثدييات و colliculus السفلي في الدماغ الأوسط. بالنظر إلى أوجه التشابه هذه ، فإن تكوين ABR للطيور حتى الدماغ المتوسط السمعي قابل للمقارنة عبر جميع الفقاريات.
في حين أن العديد من أنواع الطيور تظهر ثلاث قمم إيجابية في غضون 6 مللي ثانية بعد بداية التحفيز ، فإن العلاقة بين قمم ABR والهياكل السمعية المركزية لها بعض التباين. يمكن افتراض أن الموجة الأولى هي الاستجابة العصبية الأولى من الحليمة القاعدية الطرفية والعصب السمعي وتظهر القليل من التباين بين الأفراد (الشكل 1C). تحديد الموجة اللاحقة أقل تأكيدا وقد يختلف بين الأنواع. قرر Kuokkanen et al.17 مؤخرا أن الموجة الثالثة من ABR لبومة الحظيرة يتم إنشاؤها بواسطة NL. وبالتالي ، من المعقول القول بأن الموجة الثانية تنشأ من NM و NA من نواة القوقعةالصناعية 20. ومع ذلك ، تم تعريف موجة البومة الثالثة على أنها الذروة الإيجابية التي تم إنشاؤها بعد 3 مللي ثانية بعد بدء التحفيز. هذا يتوافق مع الموجة الثانية كما هو محدد في الدجاج الفقس ABR. في بومة الحظيرة ABR ، تم الجمع بين الموجتين الأولى والثانية.
في حين أن الدجاج المفرخ عادة ما يقدم مع ثلاث قمم في حدود 6 مللي ثانية ، فقد لوحظت أحيانا ذروة رابعة (على سبيل المثال ، انظر الشكل 1 أ). ستكون هناك حاجة إلى بيانات سكانية ، وحجم عينة أكبر ، ونماذج تجريبية إضافية لدعم موجة رابعة ، وفي بعض الحالات ، ABR دجاج من خمس موجات. كانت النتيجة الأكثر اتساقا هي تمثيلات الذروة الثلاثة الموضحة هنا.
نظرا لأن ABR يعرف بأنه مقياس للتزامن العصبي ، فإن النوى الرئيسية في المسار السمعي يمكن أن تمثل كل ذروة إيجابية في ABR. قد تحدد الإشارة التي تمر من العصب السمعي إلى NM / NA ثم إلى NL الموجات الأولى والثانية والثالثة في الدجاج الفقس ABR ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تمثل الذروة الرابعة التي تحدث لاحقا من ABR الدجاج جذع الدماغ العلوي أو البنية السمعية للدماغ المتوسط. يجب أن يأخذ توصيف ABRs الطيور في الاعتبار أيضا الفرق بين الطيور المبكرة والطيور الألتريسيال. يختلف نضج الاستجابات السمعية بين الأنواع ويتأثر أيضا بسمات حرجة أخرى مثل سلوك المفترس و / أو التعلم الصوتي4. وبغض النظر عن ذلك، فإن الأساليب والتقنيات الموصوفة تطبق بسهولة على مجموعة متنوعة من أنواع الطيور والفقاريات.
يوضح الشكل 2 أهمية الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. مع انخفاض درجة حرارة الجسم الداخلية ، زاد زمن انتقال استجابات ABR لنفس مستوى شدة التحفيز. هذا أكثر وضوحا عندما تنخفض درجة حرارة الجسم إلى أقل من 32 درجة مئوية36,37. زيادة الكمون حوالي 1 مللي ثانية في ABR أقل مما تم الإبلاغ عنه سابقا في الدجاج23. ومع ذلك ، استخدم كاتاياما23 فقسا عمره 12 يوما تم تبريده وتسخينه لاحقا على مدار 4 ساعات. تم تسجيل البيانات الواردة في الشكل 2 أثناء عملية التبريد على مدى فترة 20 دقيقة. للحصول على أفضل جودة وأكثر التسجيلات اتساقا ، يجب الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان ، ويجب إجراء جميع التسجيلات في نفس درجة الحرارة الفسيولوجية بين الحيوانات.
تأثير العمر على ABR طفيف ولكن من المهم مراعاته. وفي حين أن زمن انتقال الموجتين الأولى والثانية من ABR فقط كان مختلفا اختلافا كبيرا، فإن هذا يرجع جزئيا إلى أنه لم يستخدم سوى ثلاثة صغار صغار في الشكل 3؛ أما الثلاثة الآخرون فلم يقدموا ثلاث قمم ABR يمكن التعرف عليها. وقد تكون التحولات في سعة ABR وعتبتها واضحة أيضا إذا استخدمت أحجام عينات كبيرة أو قارنت بين ABRs الخاصة بالتردد. يمكن أن يحدث هذا التأثير المرتبط بالعمر بسبب السوائل الموجودة في الأذن الوسطى للدجاج. تؤدي هذه التغييرات الموصلة إلى زيادة ملحوظة في عتبات ABR لكل من النماذج البشرية والثدييات الأخرى38,39.
باستخدام اثنين من مونتاج التسجيل المختلفين ، لوحظت استجابات مماثلة (الشكل 4A). في حين أن المونتاج الأكثر شيوعا يضع القطب المرجعي خلف الأذن المستقبلة للتحفيز ، فإن وجود القطب المرجعي في أنسجة الرقبة يمكن أن يكون مفيدا إذا كان هناك تدخل جراحي مصاحب ل ABR. ومع ذلك ، إذا تم استخدام تسجيلات ABR ثنائية القناة ، فيجب وضع الأقطاب الكهربائية المرجعية بشكل منفصل ومتماثل ، وهو أمر صعب إذا تم وضع القطب المرجعي في الرقبة. يوصى باستخدام موضع الخشاء للقطب المرجعي لتوحيد أكبر عدد ممكن من جوانب التسجيل. يعد تسجيل ABR ثنائي القناة أداة فعالة تتطلب القليل من التحضير الإضافي وتؤدي إلى استجابات مماثلة بين الأذنين. من المحتمل أن تكون الاختلافات الطفيفة في السعة بسبب وضع سماعة الأذن. يسمح التسجيل ثنائي القناة بإجراء مقارنة سهلة بين الأذن أو نصف الكرة المخية الذي تم التلاعب به تجريبيا مقابل عنصر التحكم. سيكون هذا الإعداد مطلوبا أيضا لاختبار ABRs بكلتا الأذنين. يمكن أن تشير التجارب المستقبلية باستخدام ABR الدجاج إلى الأدبيات السابقة حول تسجيل التكوينات والمونتاج34.
هذه المنهجية تأتي مع العديد من القيود. كما ذكرنا في الخطوة 5.1 ، يمكن أن يؤدي وضع المنظار الضعيف إلى تحول 40 dBSPL استجابة لذلك. هذا يمكن أن يسبب تفسيرا غير صحيح لحيوان تم التلاعب به أو تعديله. يوصى بالاحتياطات التالية: الحصول على عينة كبيرة من بيانات التحكم قبل الحصول على ABRs للنماذج التي تم التلاعب بها أو المتحورة. لا تقلل من شدة التحفيز بأكثر من 20 dBSPL بين التسجيلات. إذا تغيرت السعة أو الكمون أكثر من المتوقع ، فتحقق من وضع الحيوان والمضارب. كرر هذا الحافز ABR لمراقبة التغييرات. إذا تحرك المنظار ، فاستعيد الاختبارات السابقة. هناك قيد آخر هو معايرة ABRs. بدون معايرة مناسبة لتسجيل مستوى ضغط الصوت ، فإن الكثافة المقدمة للحيوان غير معروفة. عند قياس إخراج الصوت ، استخدم نفس المنظار كما هو الحال في التسجيل التجريبي وميكروفون صغير داخل تجويف يقارب طول قناة أذن الحيوان (~ 5 مم). قم بقياس نفس ترددات النغمة المستخدمة في التجارب، حيث أن المعايرة خاصة بالتردد. قد يأتي الدليل الخاص بكل من أنظمة الأجهزة والبرامج مع إرشادات للمعايرة. هناك أيضا مرشحات إضافية مثل مرشحات الطور الخطي والحد الأدنى للطور ، والتي يمكن أن تحسن من النقر والنغمة المتلاحقة ABRs43. لم يتم استخدام هذه المرشحات في هذه الدراسة. كما لم يتم فحص اعتبارات إضافية، مثل زمن الارتفاع والهبوط لغلاف طيفي لانفجار نغمة يتغير كدالة للتردد أو تغيير وقت الارتفاع والانخفاض لمحفزات النقر. هذه تحقيقات مستقبلية جيدة بمجرد الحصول على ABRs موثوقة ومتسقة.
مقارنة الدجاج الفقس مع نماذج الطيور الأخرى واعدة. كما تعرض الببغاء والبوم الشرقي الصراخ ثلاث قمم ميكروفولت إيجابية خلال أول 6 مللي ثانية من ABR13,22. في أنواع مختلفة من نقار الخشب ، ينظر إلى ثلاث قمم أيضا ، ولكن الكمون الخاص بها في وقت لاحق في الوقت المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، يتراوح نطاق أفضل حساسية للتردد في نقار الخشب بين 1500 و 4000 هرتز ، وهو أعلى إلى حد ما من أفضل عتبة للدجاج عند 1000 هرتز. في الدجاج البالغ ، تكون أفضل حساسية عند 2000 هرتز35 ، لذلك قد يكون هناك تحسين في سماع الترددات العالية مع تطور فراخ الدجاج إلى بالغين. سيختلف هذا التطور بين أنواع الطيور ، مع الأخذ بعين الاعتبار التطور الألتريسي أو المبكر للحيوان4.
يمكن أن تساعد الطرق التجريبية الموضحة هنا في تحديد العوامل التي تؤدي إلى أضرار أو تغييرات في الاستجابات والعتبات السمعية ، بالإضافة إلى الدراسات في مراحل مختلفة من التطور الجنيني. التلاعب الجيني والشيخوخة والتعرض للضوضاء كلها تلاعبات معروفة في الحيوانات ونماذج الطيور الأخرى24،25،44،45. يجب توسيع هذه الطرق لتشمل نموذج الدجاج الآن بعد أن سمحت تقنيات مثل الكهربية داخل البويضة بالتعبير عن البروتينات التي يتم التحكم فيها بشكل فوكلي وزمني في جانب واحد من جذع الدماغ السمعي 12,46. وهذا يسمح بالمقارنة المباشرة بين ABRs من الأذن التي تم التلاعب بها وراثيا إلى أذن التحكم المعاكسة باستخدام نموذج تسجيل ثنائي القناة.
بشكل عام ، يعد ABR لتفريخ الدجاج طريقة بحث مفيدة ، متطابقة تقريبا مع مقاييس وظيفة السمع في النماذج البشرية والثدييات الأخرى. وهي أيضا منهجية غير غازية في الجسم الحي . بصرف النظر عن الحقن المخدر ووضع القطب الكهربائي تحت الجلد لبضعة ملليمترات ، لا يلزم أي تلاعب مادي آخر. يمكن نظريا اختبار الفقس عدة مرات على مدار أيام أو أسابيع من أيام أو أسابيع إذا تم الاحتفاظ به في بيئة مناسبة. لا يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة ومعلمات التسجيل لدجاج الفقس ABR فحسب ، بل يقترح أيضا خصائص ABR الطيور التي يمكن أن تفيد في إجراء المزيد من الاختبارات في وظيفة جذع الدماغ السمعي.
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |