In vivo Tomografia por emissão de pósitrons para revelar padrões de atividade induzidos pela estimulação cerebral profunda em ratos

Summary

Descrevemos um método experimental pré-clínico para avaliar a neuromodulação metabólica induzida por estimulação cerebral profunda aguda com FDG-PET in vivo. Este manuscrito inclui todas as etapas experimentais, desde a cirurgia estereotáxica até a aplicação do tratamento de estimulação e a aquisição, processamento e análise de imagens PET.

Abstract

A estimulação cerebral profunda (DBS) é uma técnica neurocirúrgica invasiva baseada na aplicação de pulsos elétricos a estruturas cerebrais envolvidas na fisiopatologia do paciente. Apesar da longa história da DBS, seu mecanismo de ação e protocolos apropriados permanecem obscuros, destacando a necessidade de pesquisas que visem resolver esses enigmas. Nesse sentido, avaliar os efeitos in vivo da DBS usando técnicas de imagem funcional representa uma estratégia poderosa para determinar o impacto da estimulação na dinâmica cerebral. Aqui, um protocolo experimental para modelos pré-clínicos (ratos Wistar), combinado com um estudo longitudinal [¹⁸F]-fluorodesoxiclucose tomografia por emissão de pósitrons (FDG-PET), para avaliar as consequências agudas da DBS no metabolismo cerebral é descrito. Primeiro, os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação bilateral de eletrodos no córtex pré-frontal. Uma tomografia computadorizada (TC) pós-cirúrgica de cada animal foi adquirida para verificar a colocação do eletrodo. Após uma semana de recuperação, um primeiro FDG-PET estático de cada animal operado sem estimulação (D1) foi adquirido e, dois dias depois (D2), um segundo FDG-PET foi adquirido enquanto os animais eram estimulados. Para isso, os eletrodos foram conectados a um estimulador isolado após a administração de FDG aos animais. Assim, os animais foram estimulados durante o período de captação do FDG (45 min), registrando os efeitos agudos da DBS no metabolismo cerebral. Dada a natureza exploratória deste estudo, as imagens FDG-PET foram analisadas por uma abordagem voxel-wise baseada em um teste T pareado entre os estudos D1 e D2. No geral, a combinação de DBS e estudos de imagem permite descrever as consequências da neuromodulação em redes neurais, ajudando a desvendar os enigmas em torno da DBS.

Introduction

O termo neuroestimulação engloba uma série de diferentes técnicas destinadas a estimular o sistema nervoso com um objetivo terapêutico¹. Dentre elas, a estimulação cerebral profunda (ECP) destaca-se como uma das estratégias de neuroestimulação mais difundidas na prática clínica. A DBS consiste na estimulação de núcleos cerebrais profundos com pulsos elétricos entregues por um neuroestimulador, implantados diretamente no corpo do paciente, através de eletrodos colocados no alvo cerebral para serem modulados por cirurgia estereotáxica. O número de artigos que avaliam a viabilidade da aplicação da DBS em diferentes distúrbios neurológicos e psiquiátricos está crescendo continuamente², embora apenas alguns deles tenham sido aprovados pela Food and Drug Association (FDA) (ou seja, tremor essencial, doença de Parkinson, distonia, transtorno obsessivo-compulsivo e epilepsia clinicamente refratária)³ . Além disso, um grande número de alvos cerebrais e protocolos de estimulação estão sob pesquisa para o tratamento DBS de muito mais patologias do que o oficialmente aprovado, mas nenhum deles é considerado definitivo. Essas inconsistências na pesquisa e nos procedimentos clínicos da DBS podem, em parte, ser devidas à falta de compreensão completa de seu mecanismo de ação⁴. Portanto, enormes esforços estão sendo feitos para decifrar os efeitos in vivo do DBS na dinâmica cerebral, pois cada avanço, por menor que seja, ajudará a refinar os protocolos DBS para um maior sucesso terapêutico.

Nesse contexto, as técnicas de imagem molecular abrem uma janela direta para observar in vivo os efeitos neuromoduladores da DBS. Essas abordagens oferecem a oportunidade não apenas de determinar o impacto da DBS enquanto ela está sendo aplicada, mas também de desvendar a natureza de suas consequências, prevenir efeitos colaterais indesejados e melhora clínica e até mesmo adaptar os parâmetros de estimulação às necessidades do paciente⁵. Dentre esses métodos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) utilizando 2-desoxi-2-[¹⁸F]fluoro-D-glicose (FDG) é de particular interesse porque fornece informações específicas e em tempo real sobre o estado de ativação de diferentes regiões cerebrais⁶. Especificamente, a imagem FDG-PET fornece uma avaliação indireta da ativação neural com base no princípio fisiológico do acoplamento metabólico entre neurônios e células gliais⁶. Nesse sentido, vários estudos clínicos relataram padrões de atividade cerebral modulados por DBS usando FDG-PET (ver³ para revisão). No entanto, os estudos clínicos incorrem facilmente em várias desvantagens quando se concentram nos pacientes, como heterogeneidade ou dificuldades de recrutamento, que limitam fortemente seu potencial de pesquisa⁶. Esse contexto leva os pesquisadores a utilizarem modelos animais de condições humanas para avaliar abordagens biomédicas antes de sua tradução clínica ou, se já aplicadas na prática clínica, para explicar a origem fisiológica dos benefícios terapêuticos ou efeitos colaterais. Assim, apesar das grandes distâncias entre a patologia humana e a condição modelada em animais de laboratório, essas abordagens pré-clínicas são essenciais para uma transição segura e eficaz para a prática clínica.

Este manuscrito descreve um protocolo experimental de DBS para modelos murinos, combinado com um estudo longitudinal FDG-PET, a fim de avaliar as consequências agudas da DBS no metabolismo cerebral. Os resultados obtidos com este protocolo podem ajudar a desvendar os intrincados padrões modulatórios induzidos na atividade cerebral pela DBS. Portanto, uma estratégia experimental adequada para examinar in vivo as consequências da estimulação é fornecida, permitindo que os médicos antecipem os efeitos terapêuticos em circunstâncias específicas e, em seguida, adaptem os parâmetros de estimulação às necessidades do paciente.

Protocol

Os procedimentos experimentais em animais foram conduzidos de acordo com a Diretiva 2010/63/UE do Conselho das Comunidades Europeias e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Hospital Gregorio Marañón. Um resumo gráfico do protocolo experimental é mostrado na Figura 1A. 1. Localização do alvo cerebral por neuroimagem in vivo Preparação animalNOTA: Foram utilizados ratos Wistar machos de ~300 g.C…

Representative Results

Os animais foram sacrificados com CO2 ao final do estudo ou quando o bem-estar do animal estava comprometido. Um exemplo de um estudo completo de PET/CT de um animal operado é mostrado na Figura 3. Assim, o eletrodo inserido no cérebro do rato pode ser claramente observado na imagem da TC mostrada na Figura 3A. Essa modalidade de imagem fornece boas informações anatômicas e facilita o registro de imagens FDG-PET, uma vez que as modalidades funcio…

Discussion

Dados os avanços na compreensão da função cerebral e das redes neurais envolvidas na fisiopatologia dos transtornos neuropsiquiátricos, cada vez mais pesquisas estão reconhecendo o potencial da DBS em uma ampla gama de patologias de base neurológica². No entanto, o mecanismo de ação desta terapia permanece incerto. Diversas teorias têm tentado explicar os efeitos obtidos em circunstâncias patológicas e de estimulação específicas, mas a heterogeneidade dos estudos propostos dificulta…

Materials

7-Tesla Biospec 70/20 scanner	Bruker, Germany	SN0021	MRI scanner for small animal imaging
Betadine	Meda Pharma S.L., Spain	644625.6	Iodine solution (iodopovidone)
Beurer IL 11	Beurer	SN87318	Infra-red light
Bipolar cable 50 cm w/50 cm mesh covering up to 100 cm	Plastics One, USA	305-305 (CM)
Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm	Plastics One, USA	305-340/2	Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm
Buprex	Schering-Plough, S.A	961425	Buprenorphine (analgesic)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IM	Laboratorio Reig Jofré S.A., Spain	624239.1	Ceftriaxone (antibiotic)
Commutator	Plastics One, USA	SL2+2C	4 Channel Commutator for DBS
Concentric bipolar platinum-iridium electrodes	Plastics One, USA	MS303/8-AIU/Spc	Electrodes for DBS
Driller	Bosh	T58704	Driller
FDG	Curium Pharma Spain S.A., Spain	—–	2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer)
Heating pad	DAGA, Spain	23115	Heating pad
Ketolar	Pfizer S.L., Spain	776211.9	Ketamine (anesthetic drug)
Lipolasic 2 mg/g	Bausch & Lomb S.A, Spain	65277	Ophthalmic lubricating gel
MatLab R2021a	The MathWorks, Inc		Support software for SPM12
MRIcro	McCausland Center for Brain Imaging,  University of South Carolina, USA	v2.1.58-0	Software for imaging preprocessing and analysis
Multimodality Workstation (MMWKS)	BiiG, Spain		Software for imaging processing and analysis
Omicrom VISION VET	RGB Medical Devices, Spain	731100 ReV B	Cardiorrespiratory monitor for small imaging
Prevex Cotton buds	Prevex, Finland	—–	Cotton buds
Sevorane	AbbVie Spain, S.L.U, Spain	673186.4	Sevoflurane (inhalatory anesthesia)
Small screws	Max Witte GmbH	1,2 x 2 DIN 84 A2	Small screws
Standard U-Frame Stereotaxic Instrument for Rat, 18° Ear Bar	Harvard Apparatus, USA	75-1801	Two-arms Stereotactic frame for rat
Statistical Parametric Mapping (SPM12)	The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK	SPM12	Software for voxel-wise imaging analysis
STG1004	Multi Channel Systems GmbH, Germany	STG1004	Isolated stimulator
SuperArgus PET/CT scanner	Sedecal, Spain	S0026403	NanoPET/CT scanner for small animal imaging
Suture thread with needle, 1/º	Lorca Marín S.A., Spain	55325	Braided natural silk non-absorbable suture 1/0, with triangle needle
Technovit 4004 (powder and liquid)	Kulzer Technique, Germany	64708471; 64708474	Acrylic dental cement for craniotomy tap
Wistar rats (Rattus norvergicus)	Charles River, Spain	animal facility	Animal model used
Xylagesic	Laboratorios Karizoo, A.A, Spain	572599-4	Xylazine (anesthetic drug)
	Normon S.A., Spain	602910	Mepivacaine in gel for topical use