크론병에서 기계적 스트레스의 병원성 역할을 연구하는 TNBS 유도 설치류 모델
Summary
본 프로토콜은 설치류에서 크론과 같은 대장염 모델의 개발을 설명합니다. 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서 협착으로 이어지고, 협착증에 근접한 세그먼트에서 기계적 확대가 관찰됩니다. 이러한 변화는 대장염의 기계적 스트레스를 연구 할 수있게합니다.
Abstract
크론병(CD)과 같은 염증성 장 질환(IBD)은 유럽과 미국에서 1,00,000명당 약 20명에 영향을 미치는 위장관의 만성 염증성 질환이다. CD는 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증을 특징으로합니다. 항염증 요법은 염증을 조절하는 데 도움이 될 수 있지만 CD의 섬유증과 협착증에는 효능이 없습니다. CD의 병인은 잘 이해되지 않는다. 현재의 연구는 주로 조절되지 않는 장 면역 반응 메커니즘을 묘사하는 데 중점을 둡니다. CD 관련 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증은 모두 장 벽에 대한 기계적 스트레스를 나타내는 반면, CD에서 기계적 스트레스의 역할은 잘 정의되어 있지 않습니다. 기계적 스트레스가 CD에서 독립적 인 병원성 역할을하는지 여부를 결정하기 위해 설치류에서 TNBS 유도 CD 유사 대장염 모델의 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 TNBS-유도된 경막 염증 및 섬유증 모델은 결장에서의 CD의 병리학적 특징과 유사하다. 그것은 성인 Sprague-Dawley 래트의 원위 결장으로의 TNBS의 결장 내 점적에 의해 유도된다. 이 모델에서, 경막 염증은 TNBS 점안 부위 (부위 I)에서 협착을 일으킨다. 기계적 팽만감은 점적 부위(Site P)에 근접한 부분에서 관찰되며, 기계적 응력을 나타내지만 눈에 보이는 염증은 나타낸다. 염증에 원위 결장 부분 (사이트 D)은 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 다른 부위 (P, I 및 D)에서 유전자 발현, 면역 반응, 섬유증 및 평활근 성장의 독특한 변화가 관찰되어 기계적 스트레스의 중대한 영향을 강조했습니다. 따라서이 CD 유사 대장염 모델은 CD의 병원성 메커니즘, 특히 면역 조절 장애, 장 섬유증 및 CD의 조직 리모델링에서 기계적 스트레스 및 기계적 스트레스 유발 유전자 발현의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)을 포함하는 염증성 장 질환(IBD)은 위장관(GI) 관에서 만성 염증을 특징으로 한다. 그것은 ~ 1-2 백만 명의 미국인에게 영향을 미칩니다1. 미국의 IBD 치료에 대한 예상 연간 비용은 $ 11.8 억입니다. UC와는 달리, CD는 경막 염증 및 협착 형성 2,3을 특징으로 한다. 협착 형성(stenosis)은 CD 환자3의 최대 70%에서 발생하며, 경막 염증(염증성 협착) 또는 장 섬유증(fibrotic stenosis)4,5에 의해 유발될 수 있다. 장 섬유증은 공정 3,4에 관여하는 주요 중간엽 세포 유형 중 하나로서 평활근 세포 (SMC)와 함께 과도한 콜라겐 침착 및 기타 세포외 매트릭스 (ECM)를 특징으로합니다. 비대와 관련된 평활근 과형성은CD6에서 섬유성 협착증의 또 다른 중요한 조직학적 변화이다. CD의 협착 형성은 만성 염증과 관련이 있지만, 외과 적 치료 2,6을 제외하고는 항 염증 치료가 효과적이지 않습니다. 그러나 수술 후 재발은 충분한 시간 2,7을 감안할 때 거의 100 %입니다. 염증 반응으로서, 섬유증 및 SMC 증식은 또한 장8,9에서 비염증성 상태 (즉, 장 폐쇄)에서 발생할 수 있다; 염증-의존적 및 독립적인 메카니즘 둘 모두가 협착 형성에 관여하는 것으로 여겨진다 3,4. 염증 의존성 메커니즘에 대한 광범위한 연구가 협착 형성을위한 효과적인 치료법으로 번역되지 않았 음을 감안할 때, 장 섬유증에서 염증 독립적 인 메커니즘의 가능한 역할에 대한 연구가 필요합니다.
비염증성 인자로서, 부종, 염증성 세포 침윤, 조직 변형, 섬유증, 및 협착증과 관련된 기계적 스트레스 (MS)10,11,12,13은 IBD, 특히 경막 염증을 특징으로 하는 CD에서 흔히 마주친다. 기계적 스트레스는 협착 CD에서 가장 현저하며, 염증 부위의 협착 (염증 또는 섬유성)은 국소 조직에 기계적 스트레스를 제공하고 폐색 부위10,14에 근접한 세그먼트에서 내강 팽창을 유도합니다. 이전의 시험관내 연구는 기계적 스트레스가 위장 조직, 특히 장 평활근 세포 (SMC)16에서 특정 염증 매개체 (즉, COX-2, IL-6)8,14,15 및 성장 인자 (즉, TGF-β)의 유전자 발현을 변화시킨다는 것을 입증했다. 최근의 연구는 또한 결합 조직 성장 인자 (CTGF)와 같은 특정 친 섬유성 매개체의 발현이 기계적 스트레스에 매우 민감하다는 것을 발견했다17,18. 기계적 스트레스가 CD 관련 염증, 섬유증 및 조직 리모델링에서 독립적 인 병원성 역할을 할 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 그러나 CD에서 장 염증, 섬유증 및 평활근 증식증에서 기계적 스트레스의 병원성 중요성은 크게 탐구되지 않은 채로 남아 있습니다. 이것은 부분적으로 염증이 기계적 스트레스보다 더 눈에 띄고 더 잘 연구 된 과정이기 때문일 수 있습니다. 더 중요한 것은, 기계적 스트레스의 효과와 염증의 효과를 구별하기 위해 IBD의 잘 정의 된 동물 모델이 없다는 것입니다.
현재의 연구는 CD에서 기계적 스트레스의 역할을 연구하는 목적을 달성 할 수있는 합텐 시약 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS) 19,20의 결장 내 주사에 의해 유도 된 크론과 같은 대장염의 설치류 모델을 설명합니다. TNBS 점안이 원위 결장에서의 내강 협착(stenosis)과 함께 국소적인(~2 cm 길이) 경막 염증을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 협착증은 현저한 장 팽만감 (기계적 스트레스)14,15로 이어지지만 점안 부위에 인접한 결장 세그먼트에서는 눈에 보이지 않는 염증을 일으킨다. 반대로, 협착 부위의 원위 결장 세그먼트는 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 유전자 발현, 염증, 섬유증, 및 SMC 과형성의 유의한 부위-특이적 변화가 세 개의 상이한 부위에서 관찰되었다. 결과는 기계적 스트레스, 특히 기계적 스트레스로 인한 유전자 발현이 크론 대장염에서 섬유증과 과형성을 일으키는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS 유발 대장염은 1989년에 도입되었으며 그 후 19,20,23년 이후 크론병의 실험 모델로 사용되어 왔다. 설치류에서이 모델의 중요한 특징은 인간 크론 병19,20에서 개발 된 조직 병리학 적 병변과 매우 유사한 경벽 염증의 발달을 포함합니다. 모델에 대한 이전의 연구는 주로 눈에 보이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH (R01 DK124611에서 XZS로)와 미국 국방부 (W81XWH-20-1-0681에서 XZS로)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. 조직학 작업은 UTMB 외과 병리학 연구소의 도움으로 수행되었습니다.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
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