Analyser av proteinuri, njurinfiltration av leukocyter och njuravsättning av proteiner hos lupusbenägna MRL/lpr-möss

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att spåra lupusprogression hos möss. Två ytterligare procedurer presenteras för att karakterisera lupusnefrit baserat på cellinfiltration och proteinavsättning i njurarna.

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en autoimmun sjukdom utan känt botemedel och kännetecknas av ihållande inflammation i många organ, inklusive njurarna. Under sådana omständigheter förlorar njuren sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer, vilket så småningom leder till njursvikt. Kvinnor, särskilt de i fertil ålder, diagnostiseras nio gånger oftare än män. Njursjukdom är den vanligaste dödsorsaken hos SLE-patienter. Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att mäta utsöndrade proteinnivåer i insamlad urin och spåra lupusprogression över tid. Dessutom tillhandahålls ett tillvägagångssätt för att isolera njurmononukleära celler baserat på storlek och densitetsval för att undersöka njurinfiltration av leukocyter. Vidare har en immunohistokemisk metod utvecklats för att karakterisera proteinavsättning i glomeruli- och leukocytinfiltrationen i tubulointerstitiella utrymmet. Tillsammans kan dessa metoder hjälpa till att undersöka utvecklingen av kronisk inflammation i samband med njurarna hos lupusbenägna MRL/lpr-möss.

Introduction

Njurens primära funktion är eliminering av giftiga ämnen genom urin samtidigt som homeostasen av vatten och salter bibehålls¹. Denna funktion hotas hos patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), vilket leder till så kallad lupusnefrit (LN). LN är en följd av att immunsystemet attackerar njurarna, vilket leder till ihållande njurinflammation och därför förlorar sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer. Detta kommer så småningom att leda till njursvikt, vilket kan vara dödligt. Under den nefritiska processen rekryteras cirkulerande B-celler, T-celler och monocyter till njurarna och utsöndrar kemokiner, cytokiner och immunkomplexbildande autoantikroppar. Detta resulterar i slutändan i endotelcellskador, membranskador, renal tubulär atrofi och fibros².

MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) lupusbenägna möss är en klassisk musmodell som uppvisar lupusliknande kliniska tecken som liknar humant SLE³. Denna modell har varit avgörande för att förstå en av de främsta orsakerna till dödlighet hos SLE-patienter, lupusnefrit (LN)⁴. I både humant och mus-SLE kännetecknas LN av gradvis inflammation utlöst av njuravsättning av immunkomplex, följt av komplementaktivering, rekrytering av inflammatoriska celler och förlust av njurfunktion⁵. Immunkomplexavsättningen är det första steget för att inducera kemokin- och cytokinproduktion av inneboende njurceller, vilket utökar det inflammatoriska svaret genom att rekrytera immunceller⁶. Det aktuella protokollet presenterar flera tekniker för att följa njursjukdomsprogression som analyserar cellinfiltration och immunkomplexavsättning.

Urin som samlas in varje vecka möjliggör detektering och visualisering av proteinuriens tidsförlopp före, under och efter lupusdebut. Proteinuri som biomarkör kan bestämma den biologiska utvecklingen av LN. Andra fördelar med denna teknik är att den är icke-invasiv, kostnadseffektiv och lätt att implementera⁷. När njuren fungerar perfekt är proteinurinivån konsekvent låg; Hos MRL/lpr-möss observeras dock efter 8-9 veckors ålder en gradvis ökning av proteinurinivån, som så småningom är tillräckligt hög för att orsaka njursvikt⁸. Flera reagensremsor och kolorimetriska reagenser är kommersiellt tillgängliga för att övervaka problemet. Bradford-analysen är dock billig och mycket exakt för att bestämma uppkomsten av proteinuri och förloppet av lupusnefrit. Denna analys är snabb och reagenset påverkas inte av närvaron av lösningsmedel, buffertar, reduktionsmedel och metallkelaterande medel som kan finnas i ditt prov 9,10,11.

En viktig aspekt att tänka på är cellinfiltration i njuren. Dessa infiltrat främjar patogenes genom att utlösa utsöndringen av lösliga faktorer såsom cytokiner för att förvärra inflammation¹². För att bättre förstå vilka cellpopulationer som finns i infiltraten är en användbar metod att isolera leukocyter¹³. Här används detektering av njurinfiltration av B-celler som ett exempel. Förfarandet börjar med en matsmältningsprocess med deoxiribonukleas (DNase) och kollagenas, följt av densitetsgradientseparation som tar bort skräp, röda blodkroppar och täta granulocyter. Anledningen till att isolera B-celler (CD19+) och plasmaceller (CD138⁺) är att lupusnjurar kan koncentrera dessa celler¹⁴. Det föreslås att närvaron av B-celler i små aggregat i njurarna kan indikera klonal expansion och följaktligen immunoglobulin (Ig) produktion. Plasmaceller är välkända för att vara närvarande i dessa aggregat också¹⁵. När leukocyter har isolerats kan fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) användas för att analysera cellerna av intresse vid färgning med olika fluorescenskonjugerade antikroppar.

Immunofluorescens är en av de immunhistokemiska (IHC) detektionsmetoderna som möjliggör fluorescerande visualisering av proteiner i 4 μm tjocka njurvävnadsprover. Andra IHC-detektionsmetoder beror på analyternas natur, bindningskemi och andra faktorer¹⁶. Immunofluorescens är en snabb identifieringsmetod som utsätter antigenet för dess motsvarighetsantikropp märkt med en specifik fluorokrom (eller ett fluorescerande färgämne). När den är upphetsad producerar den ljus som ett fluorescensmikroskop kan upptäcka. Denna teknik kan användas för att observera avsättningen av komplement C3 och IgG2a¹⁷. Överdriven komplementkaskadaktivering kan associeras med ett okontrollerat immunsvar och funktionsförlust¹⁸. Immunavsättning av anti-dubbelsträngade DNA (anti-dsDNA) autoantikroppar i njuren är ett stort problem¹⁹, där de med IgG2a-isotyp har associerats med LN²⁰. Specifikt uppvisar anti-dsDNA-antikroppar mer patogenicitet och affinitet till kärnmaterial och bildar immunkomplex²¹. När IgG2a är närvarande aktiveras komplementkaskaden, inklusive C3, för att rensa immunkomplexen²². C3- och IgG2a-markörerna kan kvantifieras individuellt eller överlagras för att fastställa deras korrelation.

I synnerhet är serumkreatininmätning en annan pålitlig teknik som kan användas tillsammans med mikroskopisk hematuri och njurbiopsier för att diagnostisera LN²³. Närvaron av proteinuri är emellertid en stark indikator på glomerulär skada. I den meningen kan övervakning av proteinurinivån under lupus upptäcka sjukdomsdebut och komplettera andra metoder för att diagnostisera lupus. Dessutom kan immunkomplex avsatta i glomeruli inducera ett inflammatoriskt svar, aktivera komplementsystemet och rekrytera mer inflammatoriska celler. En annan anmärkningsvärd punkt i detta protokoll är B-cellinfiltration i njurarna. Detta, tillsammans med de infiltrerade T-cellerna, förstärker lokala immunsvar som utlöser organskador. Viktigt är att klassificeringen av LN inte bara baseras på glomerulära morfologiska förändringar som ses i mikroskopi utan också immunavlagringar observerade med immunofluorescens. Därför erbjuds i detta protokoll exakta och kostnadseffektiva metoder för analys av njurfunktionen i laboratorieinställningar.

Protocol

Detta protokoll är godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Virginia Tech. Eftersom lupussjukdom har en högre incidens hos kvinnor användes endast kvinnliga MRL/lpr-möss. Provtagningen påbörjades vid 4 veckors ålder och avslutades vid 15 veckor. Mössen erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning) och föddes upp och hölls i en specifik patogenfri miljö enligt de institutionella riktlinjerna. 1. Proteinuritest…

Representative Results

Protokollet använder flera metoder för att bedöma MRL/lpr-möss för lupusnefrit. Först beskrivs ett förfarande för att studera ökade proteinurinivåer på grund av njursvikt över tid. Som visas i figur 1, honmöss behandlades med oral sondmatning av 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) som kontrollgrupp och probiotiska Lactobacillus reuteri som behandlingsgrupp, i en koncentration av 109 cfu/ml, två gånger i veckan. Behandlingen började vid 3 veckors å…

Discussion

LN är en ledande dödsorsak hos SLE-patienter, och faktorer som förvärrar sjukdomen är fortfarande oklara. Tillämpningen av detta protokoll är att karakterisera njurfunktionen med hjälp av flera metoder, inklusive mätning av proteinuri, FACS-analys av isolerade njurleukocyter och immunofluorescensfärgning av frysta njursektioner.

En viktig punkt att tänka på när man samlar urin är att man måste vara konsekvent med tiden på dagen och platsen för urinuppsamling. Möss är nattlig…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis