Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63509
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

يشرح المقال كيفية إزالة العينين جراحيا من يرقات الزرد الحية كخطوة أولى نحو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو التكتوم البصري وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، توفر المقالة معلومات حول تخدير اليرقات وتثبيتها وتشريح الدماغ ، تليها الكيمياء النسيجية المناعية والتصوير البؤري.

Abstract

تظهر أسماك الزرد نموا ملحوظا مدى الحياة وقدرات تجديدية. على سبيل المثال، تدعم منافذ الخلايا الجذعية المتخصصة التي تم إنشاؤها أثناء التكوين الجنيني النمو المستمر للنظام البصري بأكمله، سواء في العين أو الدماغ. يضمن النمو المنسق بين الشبكية والتكتوم البصري رسم خرائط دقيقة للشبكية مع إضافة خلايا عصبية جديدة في العينين والدماغ. لمعالجة ما إذا كانت محاور الشبكية توفر معلومات حاسمة لتنظيم سلوكيات الخلايا الجذعية التكتالية والسلف مثل البقاء على قيد الحياة والانتشار و / أو التمايز ، من الضروري أن تكون قادرا على مقارنة الفصوص التكتالية المعصبة والمتوترة داخل نفس الحيوان وعبر الحيوانات.

الاستئصال الجراحي لعين واحدة من الزرد اليرقي الحي تليها مراقبة التكتوم البصري يحقق هذا الهدف. يوضح الفيديو المصاحب كيفية تخدير اليرقات ، وشحذ إبر التنغستن كهربائيا ، واستخدامها لإزالة عين واحدة. ويوضح بعد ذلك كيفية تشريح الأدمغة من يرقات الزرد الثابتة. وأخيرا، يقدم الفيديو لمحة عامة عن بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية وعرضا توضيحيا لكيفية تركيب الأجنة الملطخة في الأغاروز منخفض درجة الانصهار للفحص المجهري.

Introduction

الهدف من هذه الطريقة هو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو وتطور التكتوم البصري ، وهو مركز المعالجة البصرية في دماغ الزرد. من خلال إزالة عين واحدة ثم مقارنة جانبي التكتوم البصري ، يمكن ملاحظة التغيرات التكتالية داخل نفس العينة وتطبيعها ، مما يتيح المقارنة عبر عينات متعددة. سوف تسفر الأساليب الجزيئية الحديثة جنبا إلى جنب مع هذه التقنية عن رؤى ثاقبة حول الآليات الكامنة وراء نمو النظام البصري وتطوره ، بالإضافة إلى الانحطاط والتجديد المحوري.

تجمع الأنظمة الحسية - البصرية والسمعية والحسية الجسدية - المعلومات من الأعضاء الخارجية وتنقل تلك المعلومات إلى الجهاز العصبي المركزي ، وتولد "خرائط" للعالم الخارجي عبر الدماغ المتوسط 1,2. الرؤية هي الطريقة الحسية السائدة لجميع الفقاريات تقريبا ، بما في ذلك العديد من الأسماك. تجمع شبكية العين، وهي النسيج العصبي في العين، المعلومات مع دائرة عصبية تتكون في المقام الأول من المستقبلات الضوئية، والخلايا ثنائية القطب، وخلايا العقدة الشبكية (RGCs)، وهي الخلايا العصبية الإسقاط في شبكية العين. تحتوي RGCs على محاور طويلة تجد طريقها عبر السطح الداخلي للشبكية إلى رأس العصب البصري ، حيث تبهر وتنتقل معا عبر الدماغ ، وتنتهي في النهاية في مركز المعالجة البصرية في الدماغ المتوسط الظهري. ويسمى هذا الهيكل التكتوم البصري في الأسماك وغيرها من الفقاريات غير الثدييات وهو متجانس مع كوليكولوس متفوقة في الثدييات3.

التكتوم البصري هو بنية متعددة الطبقات متماثلة ثنائيا في الدماغ المتوسط الظهري. في أسماك الزرد ومعظم الأسماك الأخرى ، يتلقى كل فص من التكتوم البصري مدخلات بصرية فقط من العين المقابلة ، بحيث ينتهي العصب البصري الأيسر في الفص التكتال الأيمن وينتهي العصب البصري الأيمن في الفص التكتالي الأيسر4 (الشكل 1). مثل نظيره الثدييات ، كوليكولوس المتفوق ، يدمج التكتوم البصري المعلومات البصرية مع المدخلات الحسية الأخرى ، بما في ذلك الاختبار والإحساس الجسدي ، والتحكم في التحولات في الانتباه البصري وحركات العين مثل saccades 1,5,6. ومع ذلك ، على عكس كوليكولوس الثدييات العليا ، فإن التكتوم البصري يولد باستمرار خلايا عصبية ودبقية جديدة من مكانة الخلايا الجذعية المتخصصة بالقرب من الحواف الإنسية والذيلية للفصوص التكتالية التي تسمى منطقة الانتشار التكتالي7. تساهم صيانة السلف التكاثرية في التكتوم البصري ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي ، جزئيا ، في القدرة التجديدية الرائعة الموثقة في الزرد8.

كشفت الأبحاث السابقة التي فحصت أدمغة الأسماك العمياء أو ذات العين الواحدة أن حجم التكتوم البصري يتناسب طرديا مع كمية تعصيب الشبكية التي يتلقاها9،10،11. في أسماك الكهوف البالغة ، التي تتدهور عيونها في التكوين الجنيني المبكر ، يكون التكتوم البصري أصغر بشكل ملحوظ من الأسماك السطحية المبصرة ذات الصلة الوثيقة9. يمكن منع تنكس عين سمكة الكهف عن طريق استبدال العدسة الداخلية بعدسة من سمكة سطحية أثناء التكوين الجنيني. عندما يتم تربية أسماك الكهوف ذات العين الواحدة هذه حتى مرحلة البلوغ ، يحتوي الفص التكتال المعصب على خلايا أكثر بنسبة 10٪ تقريبا من الفص التكتال غير المعصب9. وبالمثل ، في أسماك اليرقات اليرقات التي تم احتضانها بعلاجات كيميائية لتوليد عيون بأحجام مختلفة داخل نفس الفرد ، كان جانب التكتوم مع المزيد من التعصيب أكبر ويحتوي على المزيد من الخلايا العصبية10. تشير الأدلة المستقاة من تجارب سحق العصب البصري في الأسماك الذهبية البالغة إلى أن التعصيب يعزز الانتشار ، مع انخفاض تكاثر الخلايا التكتالية عندما تعطل التعصيب11.

وتأكيدا لهذه الدراسات الكلاسيكية وتوسيعها، تقدم العديد من التقارير الحديثة بيانات تشير إلى أن الانتشار استجابة للتعصيب يتم تعديله، جزئيا على الأقل، من خلال مسار BDNF-TrkB12,13. لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة حول نمو التكتوم البصري وتطوره ، بما في ذلك كيفية تعامل النظام الحسي النامي مع الإصابة وانحطاط المحور العصبي ، والإشارات الخلوية والجزيئية التي تمكن مدخلات الشبكية من تنظيم نمو التكتوم البصري ، ومتى تصبح هذه الآليات نشطة ، وما إذا كان الانتشار والتمايز المرتبطان بالتعصيب يمكنان شبكية العين وأنسجتها المستهدفة من تنسيق معدلات النمو وضمان رسم خرائط دقيقة للشبكية الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أسئلة أكبر بكثير حول التطور المعتمد على النشاط والتي يمكن معالجتها عن طريق استجواب النظام البصري لأسماك الزرد باستخدام الأساليب الجراحية مثل تلك الموضحة أدناه.

للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي يغير بها النشاط العصبي ، وتحديدا من المدخلات البصرية ، بقاء الخلايا وانتشارها ، يقارن النهج الموصوف مباشرة الفصوص التكتالية المعصبة والمشوهة (الشكل 1) داخل يرقات الزرد الفردية. تسمح هذه الطريقة بتوثيق تنكس محور RGC في التكتوم البصري وتأكيد أن عدد الخلايا الانقسامية يرتبط بالتعصيب.

Figure 1
الشكل 1: رسومات ليرقات الزرد قبل وبعد إزالة العين من جانب واحد . (أ) رسم يرقات 5 dpf كما ينظر إليها تحت المجهر تشريح. يتم تضمين كل يرقة في الأغاروز منخفض الانصهار وتوجيهها أفقيا قبل استخدام إبرة التنغستن ذات الطرف الحاد المدمن على المخدرات لإخراج العين متجهة لأعلى (العين اليسرى في هذا المثال). (ب) رسم المنظر الظهري ليرقة 9 dpf الناتجة عن الجراحة الموضحة في A. تظهر ثلاثة محاور RGC عالية التخطيط فقط من العين اليمنى وهي تزيل اللفافة وتتصل بالخلايا العصبية في الفص التكتالي الأيسر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ dps = أيام ما بعد الجراحة; RGC = خلايا العقدة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء الأساليب الواردة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في كلية ريد وكلية لندن الجامعية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول سلالات أسماك الزرد المستخدمة في هذه الدراسة.

1. إعداد المواد والأدوات

  1. تقديم الحلول.
    1. اصنع وسط جنين (E314) عن طريق تخفيف مخزون 60x (300 mM NaCl ، و 10.2 mM KCl ، و 20 mM CaCl 2-dihydrate ، و 20 mM MgCl2-hexahydrate في الماء منزوع الأيونات ، والأوتوكلاف ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة). أضف 160 مل من 60x E3 إلى 10 لتر من الماء منزوع الأيونات. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجعل 1٪ من درجة الانصهار المنخفضة (LMP) الأغاروز في E3. يذوب 1 غرام من الأغاروز LMP في 100 مل من E3 عن طريق الغليان في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة على طاقة عالية. أليكوت المنصهر الأغاروز في أنابيب microfuge 1.7 مل ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. تغلي في حمام مائي وتمسك في كتلة حرارة 40 درجة مئوية عندما تكون جاهزة للاستخدام للتضمين.
    3. اصنع محلول مارك المعدل (MMR 15) متساوي التوتر عن طريق تخفيف مخزون 10x (1 M NaCl ، 20 mM KCl ، 10 mM MgSO4 ، 20 mM CaCl 2-dihydrate ، 50 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني المعدل إلى 7.5 مع10 M NaOH ، ثم يتم تعقيمه وتخزينه في درجة حرارة الغرفة). أضف 10 مل من 10x MMR إلى 90 مل من الماء منزوع الأيونات.
  2. صب لوحات سيلغارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مما يسمح لها بضبطها وتجفيفها لعدة أيام16.
  3. شحذ إبر التنغستن كهربائيا (بروتوكول معدل من 17).
    1. أولا ، قم بإعداد محلول KOH بنسبة 10٪ (w / v) عن طريق إضافة 200 مل من الماء منزوع الأيونات إلى وعاء زجاجي واسع الفم مع غطاء لولبي. يحرك ببطء في 20 غرام من كريات KOH.
      ملاحظة: هذا المحلول الكاوي طارد للحرارة للغاية. ارتداء القفازات وحماية العين، وتحريك الحل في غطاء المحرك.
    2. قطع طول 2-3 سم من سلك التنغستن وإدخاله في حامل الإبرة.
    3. قم بتوصيل أسلاك الكاثود والأنود بمصدر الطاقة. قم بتوصيل مشبك التمساح في نهاية سلك الكاثود بمشبك ورق مستقيم جزئيا وأدخل مشبك الورق في محلول KOH ، مع إرفاقه بجانب الجرة.
    4. بعد ذلك ، قم بإرفاق مشبك التمساح لسلك الأنود بعنق حامل الإبرة. قم بتشغيل الطاقة (إلى ~ 20 فولت) واغمس سلك التنغستن في محلول KOH ، واسحب السلك من المحلول بزاوية لشحذ السلك كهربائيا إلى طرف دقيق.
      ملاحظة: ستأتي الفقاعات من مشبك الورق أثناء استمرار التفاعل.
    5. تحقق من طرف الإبرة تحت المجهر التشريحي للتأكد من أنها حادة بما فيه الكفاية.
    6. شطف الإبرة بالماء منزوع الأيونات لإزالة جميع بقايا KOH. جعل عدة إبر في وقت مبكر والحفاظ عليها حتى جراحات اليرقات وتشريحها.
  4. اصنع شرائح حجرية لتصوير عينات الزرد باستخدام مجهر متحد البؤرة مستقيم.
    1. احصل على شرائح المجهر الزجاجي وراتنجات الايبوكسي المكونة من جزأين (انظر جدول المواد). امزج الإيبوكسي وفقا للتعليمات الموجودة على العبوة ، وقم بطلاء حلقات سميكة أو مستطيلات على الشرائح الزجاجية. اسمح للشرائح بالشفاء والجفاف في غطاء المحرك لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.

2. جمع الأجنة وتربيتها

  1. قم بإقران الأسماك البالغة من الذكور والإناث من الأنماط الجينية المطلوبة في صناديق التكاثر في وقت متأخر من بعد الظهر / في وقت مبكر من المساء. في صباح اليوم التالي ، بعد أن تفرخ ، قم بجمع البيض المخصب حديثا باستخدام مصفاة شبكية ونقلها إلى E3 في أطباق بتري 100 ملم.
  2. احتضن الأجنة عند ~ 27.5 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات حتى يوم الجراحة. تغيير E3 يوميا أو حسب الحاجة.
  3. قم بإطعام اليرقات باستخدام قطارة مليئة بالروتيفر المحصود مرة واحدة في اليوم ، بدءا من 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أو بعد يوم واحد من الجراحة. بعد أن يكون لدى اليرقات عدة ساعات لتناول الطعام ، قم بتغيير E3 لإزالة أي روتيفر ومنتجات النفايات المتبقية.
    ملاحظة: لا تطعم اليرقات في يوم الجراحة.

3. إعداد اليرقات للجراحة

  1. في يوم الجراحة ، استخدم ماصة باستور الزجاجية ذات التجويف العريض لنقل 10-15 يرقات إلى طبق بتري 35 مم مملوء ب E3 الطازج.
  2. تخدير اليرقات عن طريق إضافة 3-5 قطرات من 0.4 ٪ ث / ف محلول تريكاين (0.4 غرام تريكاين مذاب في 210 مللي متر تريس ، الرقم الهيدروجيني 9 ؛ الحل النهائي المعدل إلى درجة الحموضة من 7.4 إذا لزم الأمر18) إلى الطبق للحصول على تركيز نهائي من ~ 0.0015 ٪ ث / v تريكاين. ابحث عن عدم الاستجابة للمس لتحديد ما إذا كانت اليرقات مخدرة بشكل كاف. إذا كانوا لا يزالون يستجيبون للمس بعد ~ 3 دقائق ، أضف 2-3 قطرات أخرى بنسبة 0.4٪ مع محلول Tricaine وإعادة تقييمه.
    ملاحظة: في هذه المرحلة من التطور ، من الممكن مراقبة تدفق الدم ومعدل ضربات القلب بالإضافة إلى الحركة تحت المجهر التشريحي.
  3. شل حركة يرقات الزرد المخدرة عن طريق تضمينها في 1٪ من الأغاروز LMP المذاب في E3.
    1. أولا ، ضع غطاء طبق بتري 35 مم وجها لوجه تحت المجهر التشريحي. بعد ذلك ، خذ يرقة واحدة إلى ماصة باستور الزجاجية الضيقة التجويف مع كمية صغيرة فقط من E3.
    2. ثم ، شفط ~ 200 ميكرولتر من المذابة والدافئة (~ 40 درجة مئوية) 1 ٪ LMP agarose في ماصة مع اليرقات. أخيرا ، رش اليرقة والأغاروز على غطاء طبق بتري رأسا على عقب.
    3. استخدم إبرة التنغستن الباهتة للمناورة بسرعة ولكن بلطف مع اليرقة بحيث تكون جانبية ، مع توجيه عين واحدة لأعلى. انتظر حتى يتم تعيين الأغاروز (~ 5 دقائق).
      ملاحظة: إذا تصلب الأغاروز بينما اليرقة ليست جانبية ، فقم بتحريرها من الأغاروز (كما هو موضح في الخطوة 5) وأعدها إلى الطبق باستخدام E3 و tricaine.

4. إزالة العين

  1. بمجرد ضبط الأغاروز ، ووضع اليرقة أفقيا ، استخدم طرف إبرة التنغستن الدقيقة جدا والحادة كهربائيا لاختراق الجلد حول العين ، بعد حافة مدار العين.
  2. بعد ذلك ، حرك حافة الإبرة (وليس الطرف) تحت العين من الجانب الصدغي البطني للعين. استخدم الضغط المتحكم فيه لتحرير العين من المقبس.
  3. استخدم ملقط جراحي دقيق جدا لإزالة العين عن طريق قرص العصب البصري ودفع العين من الإنسي إلى الجانبي. بدلا من ذلك ، ما عليك سوى الاستمرار في الضغط على العين ظهريا وأماميا مع جانب الإبرة ، وفي النهاية تقطيع العصب البصري وإطلاق العين.
    ملاحظة: إذا تم طعن أنسجة أخرى غير العين عن طريق الخطأ أثناء الجراحة ، فقم بقتل اليرقة بسرعة وإنسانية عن طريق قطع الرأس السريع.

5. رعاية ما بعد الجراحة حتى نقطة النهاية التجريبية

  1. بعد إزالة العين بنجاح ، قم بتغطية الأغاروز بمحلول MMR.
  2. حرر كل يرقة من الأغاروز عن طريق تنظيف إبرة التنغستن بلطف حول رأسها ثم حول جسمها مع تثبيت غطاء طبق بتري بملقط.
  3. انقل اليرقات ذات العين الواحدة إلى طبق بتري 35 مم يحتوي على MMR مكمل بتخفيف 1:100 من كوكتيل البنسلين / الستربتومايسين. احتضن الأجنة عند ~ 27.5 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات.
    ملاحظة: هذا الحل متساوي التوتر من MMR تكمله المضادات الحيوية يساعد في البداية على شفاء اليرقات والبقاء على قيد الحياة. يمكن لكل طبق أن يستوعب ما يصل إلى 15 يرقات تتعافى.
  4. في اليوم التالي ، أعد اليرقات إلى E3. بدءا من فترة ما بعد الظهر بعد الجراحة ، قم بتغذية اليرقات (~ 6 dpf وما فوق) باستخدام قطارة مليئة بالروتيفر المحصود مرة واحدة في اليوم. بعد أن يكون لدى اليرقات عدة ساعات لتناول الطعام ، قم بتغيير E3 لإزالة أي روتيفر ومنتجات نفايات متبقية.

6. إصلاح اليرقات

  1. بمجرد أن تصل اليرقات إلى مرحلة النمو المطلوبة للتحليل ، قم بتخديرها بجرعة قاتلة من التريكاين (~ 0.4٪ تركيز نهائي) حتى تتوقف قلوبهم.
  2. ماصة تصل إلى 30 يرقات لكل أنبوب microfuge 1.5 مل. قم بإزالة E3 الزائد ثم أضف 0.5-1 مل من محلول التثبيت (4٪ بارافورمالديهايد (PFA) و 4٪ سكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) لإصلاح الأنسجة. احتضان اليرقات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  3. اغسل اليرقات باستخدام PBS في اليوم التالي عن طريق إزالة المثبت وشطف اليرقات 3-4 مرات باستخدام PBS. تخزين اليرقات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام قبل تشريح.

7. تشريح اليرقات للكشف عن الأدمغة (مقتبس من 15)

  1. اليرقات الثابتة في قطرات PBS على صفيحة سيلغارد تحت مجهر تشريح. قم بتأمينها أفقيا عن طريق وضع اثنين من دبابيس التنغستن (عادة ما تكون إبر التنغستن القديمة التي تقل عن 2 سم) من خلال notochord ، مع دبوس واحد فقط خلف المنطقة المصطبغة التي تغطي منطقة الشريان الأورطي والغدد التناسلية وميزونفروس (AGM) وآخر يتماشى مع نهاية امتداد صفار البيض.
    ملاحظة: ضع دبابيس التنغستن في أقل عدد ممكن من المحاولات لأن الأنسجة ستصبح أكثر قابلية للتفتيت مع كل ثقب.
  2. استخدم إبرة التنغستن الحادة جدا والملقط الحاد بالإبرة لفضح الدماغ عن طريق إزالة العين (العينين) والأذن والفك والجهاز الهضمي وجلد الجمجمة الظهرية بهذا الترتيب.
    1. أولا ، قم بإزالة العين باستخدام تقنية مشابهة لإزالة العين الجراحية في الخطوة 4. ثم ، قم بفك اليرقة وقلبها إلى الجانب الآخر ، بحيث يمكن الوصول إلى العين الأخرى وتكرارها. بدلا من ذلك ، قم بكز الإبرة من خلال الفك إلى الجانب الآخر وإزالة العين دون فك.
      ملاحظة: يمكن جمع العيون في هذه المرحلة إذا كان تحليل هذا النسيج مطلوبا (على غرار 19).
    2. بعد ذلك ، استخدم إبرة التنغستن للخدش من الجانب الصدغي إلى الجانب البطني من الأذن. في نفس الإجراء / الحركة ، أحضر الإبرة الخلفية إلى الفك واسحبها بلطف إلى الأمام حتى تتم إزالة الأذن والفك.
    3. استخدم الملقط لسحب الأعضاء البطنية وأي صفار متبقي.
    4. أخيرا ، قم بعمل شق ضحل في جلد الجمجمة الظهرية بالقرب من التقاطع بين الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. ارفع الجلد باستخدام الملقط واسحبه أماميا وحول الدماغ الدماغي. إذا ثبت أن هذا صعب للغاية ، فابدأ في الشق الأولي في الدماغ الخلفي واسحب الجلد أولا أفقيا ثم بطنيا وأماميا ، مع الحرص الشديد على عدم خدش الحواف الجانبية للتكتوم.
      ملاحظة: نظرا لأن الدماغ المتوسط هو موضوع الدراسة ، يمكن قطع الدماغ الخلفي. ومع ذلك ، قد يؤدي شق عميق إلى قطع الرأس.
    5. إزالة أي الأنسجة المتبقية مع ملقط. قم بفك اليرقة ونقلها إلى PBS في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: اترك الذيل متصلا بالدماغ للحصول على رؤية أفضل عند تنفيذ بروتوكولات التثبيت الكامل.

8. جفاف الدماغ والتخزين

  1. إزالة PBS من الأدمغة وإضافة 1 مل من PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX-100 (PBST). حضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة PBST واستبدله بمحلول ميثانول: PBST بنسبة 50:50. حضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل الأدمغة بالميثانول 100٪ (MeOH) مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخزين الأدمغة في 100٪ MeOH في -20 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل قبل إجراء الكيمياء المناعية أو غيرها من الإجراءات الكاملة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأدمغة في MeOH لمدة تصل إلى عامين عند -20 درجة مئوية.

9. الكيمياء النسيجية المناعية

ملاحظة: يمكن العثور على البروتوكولات المعمول بها للعديد من تقنيات التركيب الكامل المفيدة في أسماك الزرد على ZFIN20. تقدم هذه المخطوطة أمثلة تقارن بين اليرقات ذات العين الواحدة والعينين التي كانت ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة التي تتعرف إما على بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) ، والذي يتم التعبير عنه في محاور العصب البصري في خط Tg[atoh7: RFP] (الشكل 2) ، أو هيستون H3 المفسفرة (PH3) ، والذي يسلط الضوء على الخلايا الانقسامية (الشكل 3). يتم تلخيص بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية القياسي للأجنة واليرقات الكاملة أدناه.

  1. أولا ، قم بإعادة ترطيب أدمغة اليرقات بسلسلة متدرجة من MeOH: PBST يغسل في درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضان العينات في 50:50 MeOH: PBST لمدة 5 دقائق ، ثم في 30:70 MeOH: PBST لمدة 5 دقائق ، وتنتهي ب 3 غسلات من PBST.
  2. لتخلل الأدمغة ، احتضنها في PBST المكمل بالبروتين K (PK) بتركيز نهائي من 20 ميكروغرام / مل PK لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخزين aliquots من 10 ملغ / مل PK في -20 درجة مئوية وإذابتها قبل الاستخدام.
  3. قم بإزالة محلول PK واغسل أي إنزيم متبقي عن طريق شطف الأدمغة باستخدام PBST 3 مرات على مدار 15 دقيقة.
  4. قم بإصلاح الأدمغة المتخلل عن طريق احتضانها في 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة). ثم ، قم بإزالة PFA وغسل أي مثبت متبقي عن طريق شطف الأدمغة 3 مرات على مدار 15 دقيقة باستخدام PBST.
  5. استبدل شطف PBST النهائي بمخزن مؤقت مانع للمناعة (IB) طازج (10٪ مصل الماعز العادي و 1٪ DMSO في PBST) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  6. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية إلى مخزن مؤقت IB بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، 1:500 ل RFP و 1:300 للأجسام المضادة PH3).
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت IB من الأدمغة واستبدله بتخفيف الأجسام المضادة الأولية. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري مع هزاز لطيف. تأكد من أن الأنابيب تستقر بشكل آمن على جوانبها.
  8. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي باستخدام ماصة دقيقة ، وشطف عدة مرات في PBST ، ثم اغسل الأدمغة في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 × 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام تخفيفات الأجسام المضادة الأولية مرة واحدة في غضون 7 أيام تقريبا إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية.
  9. شطف الأدمغة في المخزن المؤقت IB مع تخفيف الأجسام المضادة الثانوية إلى المخزن المؤقت IB بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، 1: 500 ل Alexa-fluor 568 المضادة للأرانب).
  10. قم بإزالة المخزن المؤقت IB واستبدله بتخفيف الأجسام المضادة الثانوي. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على اهتزاز مداري مع هزاز لطيف من الأنابيب التي تستقر على جانبيها.
  11. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي ، وشطفه باستخدام PBST ، ثم اغسل الأدمغة في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 × 30 دقيقة.
  12. Counterstain مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) أو ToPro3 (1:5,000 في PBST عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها).
  13. في صباح اليوم التالي ، انقل أدمغة اليرقات إلى PBS وانتقل إلى خطوات التركيب والتصوير المذكورة أدناه.

10. التركيب والتصوير

  1. قم بتأمين شريحة حجرية في غطاء طبق بتري 100 مم مع شحوم التفريغ.
  2. انقل اليرقات الملطخة بالمناعة والمعالجة إلى صفيحة بئر أو شريحة اكتئاب لعرضها باستخدام مجهر تشريح.
  3. قم بتركيب اليرقات على الشريحة الحجرية في أعمدة من 1٪ LMP agarose.
    1. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ضع يرقة واحدة على الشريحة الحجرية ، وترسب أقل قدر ممكن من PBS. مع نفس الماصة ، قم بتغطية اليرقة بأغاروز LMP المنصهر بنسبة 1٪ (~ 40 درجة مئوية).
    2. باستخدام إبرة التنغستن الحادة أو الملقط ، ارسم الأغاروز في عمود ثم ضع اليرقة بشكل متماثل قدر الإمكان ، مع رؤية السطح الظهري.
    3. كرر هذا الإجراء لليرقات المتبقية.
    4. بمجرد أن يصبح الأغاروز هلاميا ، قم بتغطيته ببضع قطرات من PBS ثم ضعه على مسرح المجهر البؤري.
  4. قم بمحاذاة العدسة الموضوعية مع العينة ، وركز المجهر باستخدام الضوء المنقول ، وأضيء العينة باستخدام أشعة الليزر المناسبة.
    ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام الأطوال الموجية 405 نانومتر و568 نانومتر لإثارة DAPI وRFP، على التوالي.
  5. اضبط الكسب والإزاحة وطاقة الليزر عن طريق تحريك أشرطة التمرير إلى مستوى مناسب بالنسبة للإشارة والكاشف المستخدم. تحقق من الرسوم البيانية لكل قناة وانقر فوق زر مؤشر حالة التشبع أعلى الصورة لقياس مستوى التعرض، مما يضمن عدم تشبع أي من وحدات البكسل وأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. للحصول على مثال على معلمات التصوير البؤري المثلى للدقة الخلوية ودون الخلوية داخل أسماك الزرد ، انظر 21.
  6. اضبط الحدود العليا والسفلى لمكدس الطائرات z باستخدام عجلة التمرير الموجودة على الماوس للعثور على الجزء العلوي والسفلي من العينة. انقر فوق الحدين العلوي والسفلي للحصول على الصورة، ثم قم بتشغيل التقاط z-stack بالنقر فوق الزر تشغيل الآن .
    ملاحظة: اعتمادا على مدى تناسق الدماغ ، سيكون إجمالي عمق z لدماغ الزرد اليرقي 9 dpf ~ 150-200 ميكرومتر.
  7. قم بمعالجة الصور وتلوينها مع وضع إمكانية الوصول إلى عمى الألوان في الاعتبار (على سبيل المثال ، استخدم الأزرق والبرتقالي أو الأرجواني والأخضر للصور ذات اللونين). قم بإعداد جداول البحث في البرنامج المستخدم لالتقاط الصور أو برامج معالجة الصور مثل Photoshop من Adobe.
  8. في Photoshop، يتم حفظ الصور الفوتوغرافية المجهرية الخام الملونة بتنسيق ملف الصورة المميز 8 بت (TIFF) عن طريق (i) تحويل وضع الصورة إلى RGB و (ii) الوصول إلى خيار المنحنيات ضمن Image | يقوم بضبط القوائم ثم (iii) تحريك مخرجات الضوء الملون المناسبة إلى مستويات 0 أو 255 لتحقيق اللون المطلوب. على سبيل المثال ، لتحقيق إشارة خضراء ، حدد القناة الحمراء وحرك مخرجاتها إلى 0 ؛ ثم حدد القناة الزرقاء وحرك مخرجاتها إلى 0 أيضا. وبالمثل ، لتحقيق إشارة أرجوانية ، حدد القناة الخضراء وحرك مخرجاتها إلى 0 ؛ اترك القنوات الحمراء والزرقاء كما هي.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوات مماثلة في برنامج معالجة صور Gnu المجاني (GIMP).
  9. قم بقياس أعداد الخلايا التي تعرض علامة معينة يدويا باستخدام المكون الإضافي لعداد الخلايا في ImageJ22 ، المتوفر ضمن تحليل في قائمة المكونات الإضافية. يمكن العثور على أمثلة حول كيفية استخدام ImageJ لحساب الخلايا في العديد من البرامج التعليمية ، بما في ذلك 23.
  10. إنشاء تمثيلات رسومية للبيانات في البرامج الإحصائية مثل RStudio (انظر البيانات التكميلية ل . ملف RMD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتأكد مما إذا كانت إزالة العين قد اكتملت وتقييم كيفية تغير التكتوم البصري ، تم إجراء العمليات الجراحية في سلالة Tg[atoh7: RFP] ، والتي تضع علامات على جميع RGCs مع RFP مستهدف بالغشاء ، وبالتالي ، جميع المحاور التي تظهر من شبكية العين وتشكل العصب البصري24. على الرغم من أن استخدام هذه السلالة ليس ضروريا للغاية ، إلا أنه يتيح المراقبة المباشرة والتصور للعصب البصري termini في neuropil tectum البصري. كما يمكن اتباع طرق أخرى لوضع العلامات على العصب البصري ، مثل تتبع المحور العصبي باستخدام أصباغ DiI أو DiO المحبة للدهون 25,26 أو وضع العلامات متعددة الأطياف باستخدام brainbow27.

كما هو موضح في الشكل 2 ، لوحظ التنكس التدريجي للمحاور العصبية الشبكية في neuropil التكتوم البصري بعد إزالة العين. وبحلول يومين بعد الجراحة، أظهرت المحاور العصبية التي تحمل علامة RFP علامات مميزة للانحطاط الواليري السريع28 مثل الخفقان والتشظي (الشكل 2A و B). وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أن الخلايا الدبقية الصغيرة تبتلع المزيد من مواد المايلين عندما يتم إسكات الخلايا العصبية29. واتساقا مع الخلايا الدبقية الصغيرة التي تجتاح أجزاء من محاور RGC المنحلة وتهاجر بعيدا عن مصدر الانحطاط، لوحظت بونكتا ساطعة تحمل علامة RFP داخل وخارج المحور العصبي التكتالي (الشكل 1B، الأسهم). وبحلول أربعة أيام بعد الجراحة، تقل المحاور المجزأة والحطام المحوري المسمى ب RFP انخفاضا كبيرا في أي من الفص التكتالي، مما يشير إلى الإزالة السريعة نسبيا للمحاور العصبية المحتضرة والمنحلة (الشكل 2C,D).

لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية الكاملة وتصور التكتوم البصري لسمك الزرد اليرقي ، تعرض الدماغ عن طريق تشريح العين (العينين) والفك والأذنين وغطاء الجمجمة للجلد والأنسجة الضامة. من الناحية المثالية ، يبقى الدماغ سليما أثناء هذا الإجراء (على سبيل المثال ، الشكل 2C ، D). ومع ذلك ، من المحتمل أن تتلف أجزاء من الدماغ الأمامي ، وخاصة المصباح الشمي ، أو تتم إزالتها بالكامل عند إزالة غطاء الجمجمة من الجلد أو الفك (الشكل 2A ، رأس السهم). علاوة على ذلك ، في بعض الأحيان يمكن تقطيع الحافة الجانبية للتكتوم عند ثقب الجلد أو قرصه لسحبه من الدماغ (على سبيل المثال ، الشكل 2A ؛ تمزق على الفص التكتالي الأيمن).

كما تم استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتقييم عدد الخلايا الانقسامية في الفصوص المعصبة وغير المعصبة في التكتوم البصري عن طريق تلطيخ الأدمغة بأكملها بجسم مضاد PH3. وتظهر هذه البيانات عددا أقل بكثير من الخلايا الانقسامية على الجانب الكثيف من أسماك اليرقات ذات العين الواحدة (p = 0.00033، اختبار Welch's t-test; الشكل 3).

Figure 2
الشكل 2: إزالة العين عند 5 dpf يؤدي إلى تنكس محاور العصب البصري. (أ-دال) إسقاطات تمثيلية ذات كثافة قصوى تظهر مناظر ظهرية للأدمغة من النوع البري من يرقات سليمة مثبتة عند 7 dpf (A) أو 9 dpf (C) ، أو يرقات ذات عين واحدة من جراحات استئصال العين عند 5 dpf ، ثابتة 2 dps (B) أو 4 dps (D). جميع النوى ملطخة ب DAPI (أخضر) ، ويتم تسمية محاور العصب البصري التي تنتهي في المحور العصبي للتكتوم البصري بواسطة الجين المحوري atoh7: RFP (أرجواني). تشير العلامة النجمية إلى العصب العصبي التكتال في اليرقات مع العين اليمنى فقط سليمة. تشير الأسهم إلى أمثلة على شظايا محاور RGC المنحلة المنبثقة من التكتوم البصري المنحرف. يشير رأس السهم إلى الأجزاء المفقودة من الدماغ الأمامي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ dps = أيام ما بعد الجراحة; RGC = خلايا العقدة الشبكية; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يزداد عدد الخلايا الانقسامية في التكتوم البصري مع التعصيب. (A-B) إسقاطات تمثيلية ذات كثافة قصوى تظهر مناظر ظهرية للأدمغة من النوع البري من يرقات سليمة (A) أو أحادية العين (B) 9 dpf ملطخة بالأجسام المضادة للعلامة الانقسامية PH3 (أرجواني) ونوى ملطخة ب DAPI (أخضر). تشير العلامة النجمية إلى عصبي تكتال معصب من العين اليمنى السليمة. (C) مخطط مربع مع جميع نقاط البيانات الفردية المتراكبة التي تبين القياس الكمي لنسبة خلايا PH3+ في الفص التكتال المعصب (يسار) مقابل الفص التكتالي المنزوع (يمين) كنسبة فرق (يسار-يمين/مجموع) ليرقات العين الواحدة (n = 12) والعينين (n = 8) 9 dpf. وسائل الشرطين مقارنة باختبار Welch t (*** ، p < 0.0005). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ dps = أيام ما بعد الجراحة; PH3 = هيستون المفسفرة H3 ؛ DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي: مخطط تفصيلي وتعليمات للمؤامرة موضحة في الشكل 3C. يحتوي هذا الملف على جميع البيانات والتعليمات البرمجية بحيث يمكن لأي شخص إعادة إنتاج مخطط الصندوق مع وضع جميع نقاط البيانات ، كما هو موضح في الشكل 3C. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح التقنيات الموصوفة في هذه الورقة واحدة من العديد من الطرق لدراسة تطور النظام البصري للفقاريات في أسماك الزرد. نشر باحثون آخرون طرقا لتشريح الشبكية الجنينية وإجراء تحليلات التعبير الجيني19 أو تصور النشاط العصبي في التكتوم البصري30. تقدم هذه الورقة نهجا لاستكشاف كيفية تأثير مدخلات الشبكية التفاضلية على سلوكيات الخلايا في التكتوم البصري.

لضمان استئصال العين بنجاح وبقاء اليرقات بعد الجراحة ، من المهم أن تكون اليرقات صحية ومخدرة بشكل كاف ومجمدة في 1٪ من الأغارو. من الأهمية بمكان أيضا أن يكون الملقط وإبر التنغستن حادة ونظيفة للغاية. تعيش اليرقات بشكل أفضل عندما لا يتم إطعامها على مدار 24 ساعة قبل الجراحة أو بعدها ، كما أن تربية اليرقات في MMR المكملة بالمضادات الحيوية تسرع عملية الشفاء. الأهم من ذلك ، أن القوة الأيونية العالية ل MMR وخاصة التركيز العالي للكالسيوم يعزز الشفاء14. ومع ذلك ، فإن التعرض لفترة أطول للملوحة العالية يمكن أن يقلل من البقاء على قيد الحياة ، على غرار ما تم توثيقه في الزرد الجنيني31. الخطوة الأكثر أهمية هي التثبيت لضمان تشريح الدماغ الناجح ، والتي تعد ضرورية لتحليل بيانات صور العينات الملطخة بالمناعة. استخدام 4٪ PFA الطازج مع 4٪ السكروز (يسمى بمودة الإصلاح الحلو) يميل إلى زيادة سهولة إزالة الجلد والحفاظ على أنسجة المخ. كما هو الحال مع العمليات الجراحية ، فإن الأدوات الحادة والنظيفة ضرورية لتشريح الأدمغة.

أحد أكبر التحديات التي تواجه هذا البروتوكول هو تضمين اليرقات لاستئصال العين. من المهم أن يجد كل شخص الطريقة التي تعمل بشكل أفضل بالنسبة له حتى يتمكن من إزالة عين اليرقات بثقة وسرعة. إذا تم طعن اليرقة عن طريق الخطأ أثناء الجراحة ، فقم بقتلها إنسانيا عن طريق قطع الرأس. التحدي الآخر هو تحديد تركيزات الأجسام المضادة الأكثر فعالية للتلطيخ المناعي الكامل. عند تحديد تركيزات الأجسام المضادة المناسبة ، استخدم الأدبيات المنشورة كنقطة انطلاق وحسن البروتوكول لأن استخدام الكواشف المنشورة على أنسجة مختلفة (خاصة على الأنسجة الأكبر أو الحيوانات الأكبر سنا) قد يتطلب تركيزات متزايدة و / أو أوقات حضانة.

القيد الرئيسي لهذه الطريقة هو الوقت الذي تستغرقه تجربة واحدة من البداية إلى النهاية وعدد الأسماك التي يمكن دراستها في أي وقت من الأوقات. فعلى سبيل المثال، استغرقت جميع البيانات المبينة في الشكل 3 حوالي شهر واحد من الاقتران الأولي للأسماك إلى جمع البيانات وتحليلها النهائيين. يمكن استكمال هذا النهج منخفض الإنتاجية نسبيا بنهج جينية غير متجانسة إما تسكت بشكل انتقائي النشاط العصبي في النظام البصري32,33 أو بواسطة الطفرات التي تفتقر إلى محاور RGC أو النشاط 34,35.

تكمن أهمية هذه الطريقة في أنها تجلب تقنية جنينية تقليدية للتأثير على خطوط الأسماك المعدلة وراثيا الحديثة ، مما يسمح بالمقارنة المباشرة بين الآليات الخلوية والجينية التي تعمل في كل من الفصوص التكتالية داخل نفس الفرد. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة ناضجة للتطبيق على الأنظمة التجريبية الأخرى ، بما في ذلك أسماك Astyanax السطحية36 و / أو يرقات الزرد المعدلة وراثيا مع الخلايا الدبقية الصغيرة المسماة بالفلورسنت37،38،39 والخلايا النجمية40 لدراسة كيفية استجابة الجهاز العصبي للأسماك النامية لمثل هذه الإصابة الدراماتيكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم تمويل هذا العمل في المقام الأول من خلال أموال بدء التشغيل من كلية ريد إلى KLC ، وأموال زمالة هيلين ستافورد للأبحاث إلى OLH ، وزمالة أبحاث العلوم في كلية ريد إلى YK. بدأ هذا المشروع في مختبر ستيف ويلسون كتعاون مع الموارد البشرية ، الذي تم دعمه من قبل Wellcome Trust Studentship (2009-2014). نشكر ماتي فارغا وستيف ويلسون وأعضاء آخرين في مختبر ويلسون على المناقشات الأولية حول هذا المشروع ، ونشكر بشكل خاص فلورنسيا كافوداسي وكيت إدواردز ، الذين كانوا أول من علم KLC كيفية تركيب الأجنة في الأغاروز وإجراء تشريح دماغ الزرد. كما نشكر غريتا غلوفر وجاي إيوينغ على المساعدة في تجميع جهاز شحذ إبرة التنغستن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes Aquaneering ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease Sigma or equivalent supplier Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL) For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5 Fine Science Tools (FST) 11252-20
Glass Pasteur pipettes DWK Lifescience 63A53 & 63A53WT For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy VWR or equivalent supplier 48311-703 Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders For making and storing solutions.
2-part epoxy resin ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent 0.85 oz syringe https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL) VWR or equivalent supplier 22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length) Fine Science Tools (FST) 26018-17 To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent Ali Express or equivalent For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 50-190-0267
Petri dishes 35 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 08-757-100A
Pipette pump SP Bel-Art or equivalent F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 909122 For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage) For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit Dow Corning 3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter) World Precision Instruments (WPI) TGW0515 Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block The Lab Depot or equivalent supplier BSH1001 or BSH1002 Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended.
Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES Sigma H7006 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 1374248 For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate Sigma M7506 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210 Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333-20ML Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets Diagnostic BioSystems DMR E404-01 Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride Sigma P3911 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride Sigma S9888 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide Sigma S5881 Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose Sigma S9378
Tricaine-S Pentair 100G #TRS1 Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG Invitrogen A-11011 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3 Invitrogen 1306 or T3605 Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418 A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH) Sigma 34860 Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum ThermoFisher Scientific 50-062Z A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3 Millipore 06-570 Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) MBL International PM005 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK) Sigma P2308-10MG Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100 Sigma T8787 Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji) Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 180 ، سمك الزرد ، الجهاز البصري ، التكتوم البصري ، استئصال العين ، تشريح الدماغ ، الكيمياء النسيجية المناعية ، الانتشار ، الانحطاط المحوري
إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski,… More

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski, E., Rouse, H., Cerveny, K. L. Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System. J. Vis. Exp. (180), e63509, doi:10.3791/63509 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter