Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Summary

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Abstract

El pez cebra exhibe un notable crecimiento de por vida y habilidades regenerativas. Por ejemplo, los nichos especializados de células madre establecidos durante la embriogénesis apoyan el crecimiento continuo de todo el sistema visual, tanto en el ojo como en el cerebro. El crecimiento coordinado entre la retina y el tectum óptico garantiza un mapeo retinotópico preciso a medida que se agregan nuevas neuronas en los ojos y el cerebro. Para abordar si los axones de la retina proporcionan información crucial para regular los comportamientos de las células madre y progenitoras tectales, como la supervivencia, la proliferación y / o la diferenciación, es necesario poder comparar los lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales.

La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo seguida de la observación del tectum óptico logra este objetivo. El video que lo acompaña muestra cómo anestesiar larvas, afilar electrolíticamente agujas de tungsteno y usarlas para extirpar un ojo. A continuación, muestra cómo diseccionar cerebros de larvas fijas de pez cebra. Finalmente, el video proporciona una visión general del protocolo para la inmunohistoquímica y una demostración de cómo montar embriones teñidos en agarosa de bajo punto de fusión para microscopía.

Introduction

El objetivo de este método es investigar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, el centro de procesamiento visual en el cerebro del pez cebra. Al extraer un ojo y luego comparar los dos lados del tectum óptico, se pueden observar y normalizar los cambios técnicos dentro de la misma muestra, lo que permite la comparación entre múltiples muestras. Los enfoques moleculares modernos combinados con esta técnica proporcionarán información sobre los mecanismos subyacentes al crecimiento y desarrollo del sistema visual, así como a la degeneración y regeneración axonal.

Los sistemas sensoriales (visual, auditivo y somatosensorial) recopilan información de los órganos externos y transmiten esa información al sistema nervioso central, generando "mapas" del mundo externo a través del^{mesencéfalo 1,2}. La visión es la modalidad sensorial dominante para casi todos los vertebrados, incluidos muchos peces. La retina, el tejido neural en el ojo, recopila información con un circuito neuronal que consiste principalmente en fotorreceptores, células bipolares y células ganglionares de la retina (RGC), las neuronas de proyección de la retina. Los RGC tienen axones largos que encuentran su camino a través de la superficie interna de la retina hasta la cabeza del nervio óptico, donde fasciculan y viajan juntos a través del cerebro, terminando finalmente en el centro de procesamiento visual en el mesencéfalo dorsal. Esta estructura se denomina tectum óptico en peces y otros vertebrados no mamíferos y es homóloga al colículo superior en mamíferos³.

El tectum óptico es una estructura multicapa bilateralmente simétrica en el mesencéfalo dorsal. En el pez cebra y la mayoría de los otros peces, cada lóbulo del tectum óptico recibe información visual únicamente del ojo contralateral, de modo que el nervio óptico izquierdo termina en el lóbulo tectal derecho y el nervio óptico derecho termina en el lóbulo tecttal izquierdo⁴ (Figura 1). Al igual que su contraparte en mamíferos, el colículo superior, el tectum óptico integra la información visual con otras entradas sensoriales, incluyendo la audición y la somatosensación, controlando los cambios en la atención visual y los movimientos oculares como las sacadas ^1,5,6. Sin embargo, a diferencia del colículo superior de los mamíferos, el tectum óptico genera continuamente nuevas neuronas y glía a partir de un nicho especializado de células madre cerca de los bordes medial y caudal de los lóbulos tectales llamado zona de proliferación^{tectal 7}. El mantenimiento de progenitores proliferativos en el tectum óptico y otras regiones del sistema nervioso central contribuye, en parte, a la notable capacidad regenerativa documentada en el pez cebra⁸.

Trabajos previos que examinaron los cerebros de peces ciegos o tuertos revelaron que el tamaño del tectum óptico es directamente proporcional a la cantidad de inervación retiniana que recibe ^9,10,11. En los peces de cueva adultos, cuyos ojos degeneran en la embriogénesis temprana, el tectum óptico es notablemente más pequeño que el de los peces de superficie avistados estrechamente relacionados⁹. La degeneración del ojo de pez de cueva se puede bloquear reemplazando la lente endógena con una lente de un pez de superficie durante la embriogénesis. Cuando estos peces de cueva tuertos se crían hasta la edad adulta, el lóbulo tectal inervado contiene aproximadamente un 10% más de células que el lóbulo tectal no inervado⁹. Del mismo modo, en los killifish larvales que fueron incubados con tratamientos químicos para generar ojos de diferentes tamaños dentro del mismo individuo, el lado del tectum con más inervación era más grande y contenía más neuronas¹⁰. La evidencia de los experimentos de aplastamiento del nervio óptico en peces de colores adultos indica que la inervación promueve la proliferación, con la proliferación de células tectales disminuyendo cuando se interrumpió la inervación¹¹.

Confirmando y extendiendo estos estudios clásicos, varios informes recientes proporcionan datos que sugieren que la proliferación en respuesta a la inervación está modulada, al menos en parte, por la vía BDNF-TrkB^12,13. Quedan muchas preguntas abiertas sobre el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, incluida la forma en que un sistema sensorial en desarrollo hace frente a las lesiones y la degeneración del axón, qué señales celulares y moleculares permiten que la entrada de la retina regule el crecimiento del tectum óptico, cuándo estos mecanismos se activan y si la proliferación y la diferenciación vinculadas a la inervación permiten que la retina y su tejido objetivo coordinen las tasas de crecimiento y garanticen un mapeo retinotópico preciso. Además, hay preguntas mucho más grandes sobre el desarrollo dependiente de la actividad que se pueden abordar interrogando el sistema visual del pez cebra con enfoques quirúrgicos como el que se describe a continuación.

Para investigar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la actividad neuronal, específicamente a partir de la entrada visual, altera la supervivencia y proliferación celular, el enfoque descrito compara directamente los lóbulos tectales inervados y denervados (Figura 1) dentro de larvas individuales de pez cebra. Este método permite la documentación de la degeneración del axón RGC en el tectum óptico y la confirmación de que el número de células mitóticas se correlaciona con la inervación.

Figura 1: Bocetos de larvas de pez cebra antes y después de la extracción unilateral del ojo. (A) Dibujo de larvas de 5 dpf vistas bajo un microscopio de disección. Cada larva está incrustada en agarosa de bajo punto de fusión y orientada lateralmente antes de que se use una aguja de tungsteno con una punta afilada y enganchada para sacar el ojo hacia arriba (ojo izquierdo en este ejemplo). (B) Dibujo de la vista dorsal de una larva de 9 dpf resultante de la cirugía representada en A. Solo tres axones RGC altamente esquematizados del ojo derecho se muestran desfasciculando y conectando con neuronas en el lóbulo tectal izquierdo. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; dps = días después de la cirugía; RGC = células ganglionares de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Los métodos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Reed College y University College London. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre las cepas de pez cebra utilizadas en este estudio.

1. Preparar materiales y herramientas

1. Hacer soluciones.
   1. Hacer embrión medio (E3¹⁴) diluyendo una cepa de 60x (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrato y 20 mM MgCl_{2-hexahidrato} en agua desionizada, autoclave y almacenada a temperatura ambiente). Añadir 160 mL de 60x E3 a 10 L de agua desionizada. Conservar a temperatura ambiente.
   2. Haga 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en E3. Disuelva 1 g de agarosa LMP en 100 ml de E3 hirviendo en el microondas durante 1-2 minutos a alta potencia. Agarosa fundida alícuota en tubos de microfuge de 1,7 ml y almacenar a 4 °C. Hervir en un baño de agua y mantener en un bloque de calor de 40 °C cuando esté listo para su uso para incrustar.
   3. Haga la solución isotónica de Marc's Modified Ringers (MMR¹⁵) diluyendo una cepa 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-dihidrato, 50 mM HEPES, pH ajustado a 7.5 con 10 M NaOH, luego autoclave y almacenado a temperatura ambiente). Agregue 10 ml de 10x MMR a 90 ml de agua desionizada.
2. Vierta las placas Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante, dejándolas reposar y secar durante varios días¹⁶.
3. Afilar electrolíticamente las agujas de tungsteno (protocolo modificado a partir del ¹⁷).
   1. Primero, prepare una solución de KOH al 10% (p/v) agregando 200 ml de agua desionizada a un frasco de vidrio de boca ancha con una tapa de rosca. Revuelva lentamente 20 g de gránulos de KOH.
      NOTA: Esta solución cáustica es altamente exotérmica. Use guantes y protección ocular, y revuelva la solución en la capucha.
   2. Corte un alambre de tungsteno de 2-3 cm de longitud e insértelo en el soporte de la aguja.
   3. Conecte los cables del cátodo y del ánodo a la fuente de alimentación. Conecte el clip de cocodrilo al final del alambre del cátodo a un clip parcialmente enderezado e inserte el clip en la solución KOH, uniéndolo al costado del frasco.
   4. A continuación, conecte el clip de cocodrilo del alambre del ánodo al cuello del soporte de la aguja. Encienda la alimentación (a ~ 20 V) y sumerja el cable de tungsteno en la solución KOH, sacando el cable de la solución en ángulo para afilar electrolíticamente el cable en una punta fina.
      NOTA: Las burbujas saldrán del clip a medida que avance la reacción.
   5. Revise la punta de la aguja debajo del microscopio de disección para asegurarse de que sea lo suficientemente afilada.
   6. Enjuague la aguja con agua desionizada para eliminar todos los residuos de KOH. Haga varias agujas con anticipación y manténgalas hasta las cirugías larvales y las disecciones.
4. Haga portaobjetos con cámara para obtener imágenes de especímenes de pez cebra con un microscopio confocal vertical.
   1. Obtenga portaobjetos de microscopio de vidrio y resina epoxi de dos partes (consulte la Tabla de materiales). Mezcle el epoxi de acuerdo con las instrucciones del paquete y pinte anillos gruesos o rectángulos en los portaobjetos de vidrio. Deje que los portaobjetos se curen y sequen en la capucha durante al menos 24 horas antes de su uso.

2. Recolección y crianza de embriones

1. Empareje peces machos y hembras adultos de los genotipos deseados en cajas de reproducción al final de la tarde / temprano en la noche. A la mañana siguiente, después de que hayan desovado, recoja los huevos recién fertilizados con un colador de malla y transfiéralos al E3 en placas de Petri de 100 mm.
2. Incubar los embriones a ~27.5 °C con un ciclo de luz de 14 h/10 h de oscuridad hasta el día de la cirugía. Cambie el E3 diariamente o según sea necesario.
3. Alimente a las larvas con un gotero lleno de rotíferos cosechados una vez al día, comenzando a los 5 días después de la fertilización (dpf) o un día después de la cirugía. Después de que las larvas tengan varias horas para comer, cambie el E3 para eliminar los rotíferos y productos de desecho restantes.
   NOTA: No alimente a las larvas el día de la cirugía.

3. Preparar las larvas para la cirugía

1. El día de la cirugía, use una pipeta Pasteur de vidrio de diámetro ancho para transferir 10-15 larvas a una placa de Petri de 35 mm llena de E3 fresco.
2. Anestesiar las larvas agregando 3-5 gotas de solución de Tricaina al 0,4% p/v (0,4 g de Tricaine disuelta en 210 mM Tris, pH 9; solución final ajustada a un pH de 7,4 si es necesario¹⁸) al plato para una concentración final de ~0,0015% p/v Tricaine. Busque la falta de respuesta al tacto para determinar si las larvas están adecuadamente anestesiadas. Si todavía responden al tacto después de ~ 3 min, agregue 2-3 gotas más de solución de Tricaine al 0.4% p / v y vuelva a evaluar.
   NOTA: En esta etapa de desarrollo, es posible controlar el flujo sanguíneo y la frecuencia cardíaca, además de la motilidad, bajo el microscopio de disección.
3. Inmovilizar las larvas de pez cebra anestesiadas incrustándolas en agarosa LMP al 1% disuelta en E3.
   1. Primero, coloque la tapa de una placa de Petri de 35 mm boca arriba debajo del microscopio de disección. A continuación, lleve una larva a una pipeta Pasteur de vidrio de diámetro estrecho con solo una pequeña cantidad de E3.
   2. Luego, aspire ~ 200 μL de agarosa LMP derretida, caliente (~ 40 ° C) al 1% en la pipeta con la larva. Finalmente, rocíe la larva y la agarosa sobre la tapa de la placa de Petri al revés.
   3. Use una aguja de tungsteno opaca para maniobrar rápida pero suavemente la larva de modo que quede lateral, con un ojo hacia arriba. Espere a que la agarosa se establezca (~ 5 min).
      NOTA: Si la agarosa se endurece mientras la larva no es lateral, libérala de la agarosa (como se describe en el paso 5) y devuélvela al plato con E3 y tricaína.

4. Extracción de ojos

1. Una vez que la agarosa está puesta, y la larva se coloca lateralmente, use la punta de una aguja de tungsteno muy fina y electrolíticamente afilada para perforar la piel alrededor del ojo, siguiendo el borde de la órbita del ojo.
2. A continuación, deslice el borde de la aguja (no la punta) debajo del ojo desde el lado temporal-ventral del ojo. Use presión controlada para liberar el ojo de la cuenca.
3. Use fórceps quirúrgicos muy finos para extirpar el ojo pellizcando el nervio óptico y empujando el ojo de medial a lateral. Alternativamente, simplemente siga presionando el ojo dorsal y anteriormente con el lado de la aguja, eventualmente cortando a través del nervio óptico y liberando el ojo.
   NOTA: Si los tejidos que no sean el ojo son apuñalados accidentalmente durante la cirugía, mate rápida y humanamente a la larva por decapitación rápida.

5. Cuidados postoperatorios hasta el criterio de valoración experimental

1. Después de la extracción exitosa del ojo, cubra la agarosa con la solución MMR.
2. Libere a cada larva de la agarosa cepillando suavemente una aguja de tungsteno alrededor de su cabeza y luego alrededor de su cuerpo mientras estabiliza la tapa de la placa de Petri con fórceps.
3. Transfiera las larvas tuertas a una placa de Petri de 35 mm que contenga MMR complementada con una dilución 1:100 de un cóctel de penicilina / estreptomicina. Incubar los embriones a ~27.5 °C con un ciclo de luz de 14 h/10 h de oscuridad.
   NOTA: Esta solución isotónica de MMR suplementada con antibióticos inicialmente ayuda a la curación y supervivencia de las larvas. Cada plato puede contener hasta 15 larvas en recuperación.
4. Al día siguiente, devuelva las larvas al E3. Comenzando la tarde después de la cirugía, alimente a las larvas (~ 6 dpf y mayores) usando un gotero lleno de rotíferos cosechados una vez al día. Después de que las larvas hayan tenido varias horas para comer, cambie el E3 para eliminar los rotíferos y productos de desecho restantes.

6. Fijación de larvas

1. Una vez que las larvas hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada para el análisis, anestesiarlas con una dosis letal de tricaína (~ 0.4% de concentración final) hasta que sus corazones se hayan detenido.
2. Pipeta de hasta 30 larvas por tubo de microfuge de 1,5 ml. Retire el exceso de E3 y luego agregue 0.5-1 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% (PFA) y sacarosa al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) para fijar el tejido. Incubar las larvas durante la noche a 4 °C.
3. Lave las larvas con PBS al día siguiente retirando el fijador y enjuagando las larvas 3-4 veces con PBS. Guarde las larvas a 4 °C durante un máximo de 7 días antes de la disección.

7. Disección de larvas para revelar cerebros (adaptado de ¹⁵)

1. Suspenda las larvas fijas en gotas de PBS en una placa de Sylgard bajo un microscopio de disección. Asegúrelos lateralmente colocando dos pasadores de tungsteno (típicamente agujas de tungsteno viejas que miden menos de 2 cm) a través de la notocorda, con un alfiler justo detrás del área pigmentada que cubre la región aorta-gónada-mesonefros (AGM) y otro en línea con el extremo de la extensión de la yema.
   NOTA: Coloque los pasadores de tungsteno en el menor número de intentos posible porque el tejido se volverá más friable con cada punción.
2. Use una aguja de tungsteno muy afilada y fórceps afilados con aguja para exponer el cerebro extirpando, en este orden, los ojos, el oído, la mandíbula, el tracto digestivo y la piel craneal dorsal.
   1. Primero, extraiga el ojo usando una técnica similar a la extirpación quirúrgica del ojo en el paso 4. Luego, desancle la larva y voltéela hacia el lado opuesto, para que el otro ojo sea accesible y repita. Alternativamente, empuje la aguja a través de la mandíbula hacia el otro lado y retire el ojo sin desanclarse.
      NOTA: Los ojos pueden ser recogidos en este punto si se desea el análisis de este tejido (similar a ¹⁹).
   2. A continuación, use la aguja de tungsteno para rascarse desde el lado temporal hasta el ventral de la oreja. En la misma acción/movimiento, lleve la aguja detrás de la mandíbula y tire suavemente hacia atrás hasta que se retiren la oreja y la mandíbula.
   3. Use fórceps para extraer los órganos ventrales y cualquier yema restante.
   4. Finalmente, haga una incisión poco profunda en la piel craneal dorsal cerca de la unión entre el cerebro posterior y la médula espinal. Levante la piel con las pinzas y tire de ella hacia arriba y alrededor del telencéfalo. Si esto resulta demasiado difícil, comience en la incisión inicial en el cerebro posterior y tire de la piel primero lateralmente y luego ventralmente y anteriormente, teniendo mucho cuidado de no rascarse los bordes laterales del tectum.
      NOTA: Debido a que el mesencéfalo es el objeto de estudio, el cerebro posterior se puede cortar; sin embargo, una incisión profunda puede resultar en decapitación.
   5. Retire cualquier tejido restante con fórceps. Desancle la larva y transfiérala a PBS en un tubo de microfuge de 1,5 ml.
      NOTA: Deje la cola unida al cerebro para una mejor visibilidad al realizar protocolos de montaje completo.

8. Deshidratación y almacenamiento cerebral

1. Retire pbS de los cerebros y agregue 1 ml de PBS que contenga 0.1% TritonX-100 (PBST). Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
2. Retire el PBST y reemplácelo con una solución de metanol:PBST 50:50. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
3. Lave los cerebros con 100% de metanol (MeOH) dos veces durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
4. Almacene los cerebros en 100% MeOH a -20 ° C durante al menos 16 h antes de realizar inmunohistoquímica u otros procedimientos de montaje completo.
   NOTA: Los cerebros se pueden almacenar en MeOH hasta por 2 años a -20 ° C.

9. Inmunohistoquímica

NOTA: Los protocolos establecidos para muchas técnicas útiles de montaje completo en el pez cebra se pueden encontrar en ZFIN²⁰. Este manuscrito proporciona ejemplos que comparan larvas de un ojo y de dos ojos que fueron inmunoteñidas con anticuerpos que reconocen la proteína fluorescente roja (RFP), que se expresa en los axones del nervio óptico en la línea Tg[atoh7:RFP] (Figura 2), o la histona fosforilada H3 (PH3), que destaca las células mitóticas (Figura 3). A continuación se resume un protocolo estándar de inmunohistoquímica para embriones y larvas de monte entero.

1. Primero, rehidrate los cerebros larvales con una serie graduada de lavados MeOH: PBST a temperatura ambiente incubando los especímenes en 50: 50 MeOH: PBST durante 5 minutos, luego en 30: 70 MeOH: PBST durante 5 minutos y terminando con 3 lavados de PBST.
2. Para permeabilizar los cerebros, incubarlos en PBST suplementado con proteinasa K (PK) a una concentración final de 20 μg/ml PK durante 30 min a 37 °C. Conservar alícuotas de 10 mg/ml de PK a -20 °C y descongelarlas antes de su uso.
3. Retire la solución de PK y lave cualquier enzima restante enjuagando los cerebros con PBST 3 veces durante 15 minutos.
4. Vuelva a fijar los cerebros permeabilizados incubándolos en PFA al 4% durante 20 min a 25 °C (o temperatura ambiente). Luego, retire el PFA y lave cualquier fijador restante enjuagando los cerebros 3 veces durante 15 minutos con PBST.
5. Reemplace el enjuague final de PBST con tampón de inmunobloqueo (IB) recién hecho (10% de suero de cabra normal y 1% de DMSO en PBST) e incube a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
6. Diluya los anticuerpos primarios en el tampón IB a la concentración adecuada (por ejemplo, 1:500 para la RFP y 1:300 para los anticuerpos PH3).
7. Elimine el tampón IB de los cerebros y reemplácelo con la dilución primaria de anticuerpos. Incubar durante la noche a 4 °C en un agitador orbital con balanceo suave. Asegúrese de que los tubos estén apoyados de forma segura en sus lados.
8. A la mañana siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos con una micropipeta, enjuague un par de veces en PBST y luego lave los cerebros en PBST a temperatura ambiente durante 4 x 30 min.
   NOTA: Las diluciones primarias de anticuerpos se pueden reutilizar una vez dentro de ~ 7 días si se almacenan a 4 ° C.
9. Enjuague los cerebros en el tampón IB mientras diluye los anticuerpos secundarios en el tampón IB a la concentración adecuada (por ejemplo, 1:500 para Alexa-fluor 568 anti-conejo).
10. Retire el tampón IB y reemplácelo con la dilución secundaria de anticuerpos. Incubar durante la noche a 4 °C en un agitador orbital con un balanceo suave de los tubos que descansan sobre sus lados.
11. A la mañana siguiente, retire la solución secundaria de anticuerpos, enjuague con PBST y luego lave los cerebros en PBST a temperatura ambiente durante 4 x 30 min.
12. Contramancha con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o ToPro3 (1:5.000 en PBST a 4 °C durante la noche).
13. A la mañana siguiente, transfiera los cerebros larvales a PBS y proceda a los pasos de montaje e imágenes que se enumeran a continuación.

10. Montaje e imágenes

1. Asegure un portaobjetos con cámara en la tapa de una placa de Petri de 100 mm con grasa al vacío.
2. Transfiera las larvas inmunoteñidas y procesadas a una placa de pozo o portaobjetos de depresión para verlas con un microscopio de disección.
3. Monte las larvas en el tobogán con cámara en columnas de agarosa LMP al 1%.
   1. Usando una pipeta Pasteur de vidrio, coloque una larva en el portaobjetos con cámara, depositando la menor cantidad de PBS posible. Con la misma pipeta, cubra la larva con agarosa LMP al 1% fundida (~40 °C).
   2. Con una aguja de tungsteno romo o fórceps, dibuje la agarosa en una columna y luego coloque la larva lo más simétricamente posible, con la superficie dorsal visible.
   3. Repita este procedimiento para las larvas restantes.
   4. Una vez que la agarosa se haya gelificado, cúbrala con unas gotas de PBS y luego colóquela en el escenario del microscopio confocal.
4. Alinee la lente del objetivo con la muestra, enfoque el microscopio utilizando la luz transmitida e ilumine la muestra con los láseres apropiados.
   NOTA: En este ejemplo, se utilizaron longitudes de onda de 405 nm y 568 nm para excitar DAPI y RFP, respectivamente.
5. Ajuste la ganancia, el desplazamiento y la potencia del láser moviendo las barras deslizantes a un nivel apropiado en relación con la señal y el detector utilizado. Compruebe los histogramas de cada canal y haga clic en el botón indicador de estado de saturación situado encima de la imagen para medir el nivel de exposición, asegurándose de que ninguno de los píxeles esté saturado y que la relación señal-ruido sea alta. Para un ejemplo de parámetros óptimos de imágenes confocales para la resolución celular y subcelular dentro del pez cebra, ver ²¹.
6. Establezca los límites superior e inferior de la pila de planos z utilizando la rueda de desplazamiento del ratón para encontrar la parte superior e inferior de la muestra. Haga clic en los límites superior e inferior para la adquisición de imágenes y, a continuación, active la captura de la pila z haciendo clic en el botón Ejecutar ahora .
   NOTA: Dependiendo de qué tan simétricamente esté montado el cerebro, la profundidad z total para un cerebro larval de pez cebra de 9 dpf será de ~ 150-200 μm.
7. Procese y coloree las imágenes teniendo en cuenta la accesibilidad daltónica (por ejemplo, use azul y naranja o magenta y verde para imágenes de dos colores). Configure tablas de búsqueda en el software utilizado para capturar las imágenes o en el software de procesamiento de imágenes, como Photoshop de Adobe.
8. En Photoshop, las fotomicrografías en bruto en color se guardan como formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF) de 8 bits (i) convirtiendo el modo de imagen a RGB y (ii) accediendo a la opción Curvas en la | Ajustes de menús y luego (iii) deslizando las salidas de luz de color apropiadas a 0 o 255 niveles para lograr el color deseado. Por ejemplo, para lograr una señal verde, seleccione el canal rojo y deslice su salida a 0; luego, seleccione el canal azul y deslice su salida a 0 también. Del mismo modo, para lograr una señal magenta, seleccione el canal verde y deslice su salida a 0; deja los canales rojo y azul como están.
   NOTA: Se pueden realizar pasos similares en el programa gratuito de manipulación de imágenes de Gnu (GIMP).
9. Cuantifique manualmente el número de celdas que muestran un marcador específico utilizando el complemento de contador de celdas en ImageJ²², disponible en Analizar en el menú Complementos. Ejemplos de cómo usar ImageJ para el conteo de celdas se pueden encontrar en muchos tutoriales, ^{incluidos 23}.
10. Generar representaciones gráficas de datos en software estadístico como RStudio (consulte los datos complementarios para . Rmd).

Representative Results

Para confirmar si la extirpación ocular fue completa y evaluar cómo cambia el tectum óptico, se realizaron cirugías en la cepa Tg[atoh7:RFP], que marca todas las RGC con una RFP dirigida a la membrana y, por lo tanto, todos los axones que se proyectan desde la retina y forman el nervio óptico²⁴. Aunque el uso de esta cepa no es absolutamente necesario, permite la observación y visualización directa del nervio óptico termini en el tectum neuropil óptico. Otros enfoques para etiquetar el nervio óptico, como el rastreo de axones con diI lipofílico o tintes DiO ^25,26 o el etiquetado multiespectral con arco cerebral²⁷, también serían posibles.

Como se muestra en la Figura 2, se observó degeneración progresiva de los axones de la retina en el tectum neuropil óptico después de la extirpación ocular. A los dos días después de la cirugía, los axones marcados con RFP exhibieron características distintivas de la degeneración walleriana rápida²⁸ , como el sangrado y la fragmentación (Figura 2A, B). Trabajos recientes han demostrado que la microglía engulle más material de mielina cuando las neuronas son silenciadas²⁹. De acuerdo con la microglía que envuelve trozos de los axones RGC degenerados y que migran lejos de la fuente de degeneración, se observaron brillantes puntas marcadas con RFP dentro y fuera del neuropil tectal (Figura 1B, flechas). A los cuatro días después de la cirugía, los axones fragmentados y los desechos axonales marcados con RFP se reducen considerablemente en cualquiera de los lóbulos tectales, lo que indica un aclaramiento relativamente rápido de los axones moribundos y degenerativos (Figura 2C, D).

Para realizar inmunohistoquímica de montaje completo y visualizar el tectum óptico del pez cebra larval, el cerebro fue expuesto diseccionando los ojos, la mandíbula, las orejas y la tapa del cráneo de la piel y los tejidos conectivos. Idealmente, el cerebro permanece intacto durante este procedimiento (por ejemplo, Figura 2C, D). Sin embargo, es probable que partes del cerebro anterior, particularmente el bulbo olfatorio, se dañen o se eliminen por completo cuando se extirpa la tapa del cráneo de la piel o la mandíbula (Figura 2A, punta de flecha). Además, a veces el borde lateral del tectum se puede cortar al perforar o pellizcar la piel para sacarla del cerebro (por ejemplo, Figura 2A; desgarro en el lóbulo tectal derecho).

La inmunohistoquímica también se utilizó para evaluar el número de células mitóticas en lóbulos inervados y no inervados del tectum óptico mediante la tinción de cerebros enteros con un anticuerpo PH3. Estos datos muestran significativamente menos células mitóticas en el lado denervado de los peces larvales tuertos (p = 0,00033, prueba t de Welch; Figura 3).

Figura 2: La extirpación ocular a 5 dpf desencadena la degeneración de los axones del nervio óptico. (A-D) Proyecciones representativas de máxima intensidad que muestran vistas dorsales de cerebros de tipo salvaje de larvas intactas fijadas a 7 dpf (A) o 9 dpf (C), o larvas tuertas de cirugías de extirpación ocular a 5 dpf, fijas 2 dps (B) o 4 dps (D). Todos los núcleos están teñidos con DAPI (verde), y los axones del nervio óptico que terminan en el neuropil del tectum óptico están marcados por el transgén atoh7:RFP (magenta). El asterisco indica neuropil tectal inervado en larvas con solo el ojo derecho intacto. Las flechas indican ejemplos de fragmentos de axones RGC degenerados que emanan del tectum óptico denervado. La punta de flecha indica partes faltantes del cerebro anterior. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; dps = días después de la cirugía; RGC = células ganglionares de la retina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El número de células mitóticas en el tectum óptico aumenta con la inervación. (A-B) Proyecciones representativas de máxima intensidad que muestran vistas dorsales de cerebros de tipo salvaje de larvas intactas (A) o tuertas (B) de 9 dpf inmunoteñidas con anticuerpos para el marcador mitótico PH3 (magenta) y núcleos contrateñidos con DAPI (verde). El asterisco indica neuropil tectal inervado del ojo derecho intacto. (C) Diagrama de caja con todos los puntos de datos individuales superpuestos que muestran la cuantificación de la relación de células PH3⁺ en lóbulo tectal inervado (izquierda) versus denervado (derecha) como una relación de diferencia (izquierda-derecha/total) para larvas de 9 dpf tuertos (n = 12) y de dos ojos (n = 8). Medias de las dos condiciones en comparación con la prueba t de Welch (***, p < 0,0005). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; dps = días después de la cirugía; PH3 = histona fosforilada H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario: Esquema e instrucciones para la gráfica que se muestran en la Figura 3C. Este archivo contiene todos los datos y el código para que cualquiera pueda reproducir el gráfico de caja con todos los puntos de datos superpuestos, como se muestra en la Figura 3C. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las técnicas descritas en este artículo ilustran uno de los muchos enfoques para estudiar el desarrollo del sistema visual de vertebrados en el pez cebra. Otros investigadores han publicado métodos para diseccionar la retina embrionaria y realizar análisis de expresión génica¹⁹ o visualizar la actividad neuronal en el tectum óptico³⁰. Este artículo proporciona un enfoque para explorar cómo la entrada diferencial de la retina puede influir en los comportamientos celulares en el tectum óptico.

Para garantizar la extirpación ocular exitosa y la supervivencia larvaria después de la cirugía, es importante que las larvas estén sanas, anestesiadas adecuadamente e inmovilizadas en agarosa al 1%. También es crucial que las pinzas y las agujas de tungsteno sean muy afiladas y limpias. Las larvas sobreviven mejor cuando no se alimentan 24 h antes o después de la cirugía, y la cría de larvas en MMR suplementada con antibióticos acelera el proceso de curación. Es importante destacar que la mayor fuerza iónica de la MMR y especialmente la mayor concentración de calcio promueve la curación¹⁴. Sin embargo, una exposición más prolongada a la salinidad más alta puede disminuir la supervivencia, similar a lo que se ha documentado en el pez cebra embrionario³¹. Un paso más crítico es la fijación para garantizar disecciones cerebrales exitosas, que son esenciales para el análisis de datos de imágenes de muestras inmunoteñidas. El uso de PFA al 4% recién hecho suplementado con sacarosa al 4% (cariñosamente llamado solución dulce) tiende a aumentar la facilidad de eliminación de la piel y la preservación del tejido cerebral. Al igual que con las cirugías, las herramientas afiladas y limpias son una necesidad para diseccionar cerebros.

Uno de los mayores desafíos de este protocolo es la incrustación de larvas para extirpaciones oculares. Es importante que cada persona encuentre la forma que mejor funcione para ellos para que puedan eliminar con confianza y rapidez el ojo larvario. Si la larva es apuñalada accidentalmente durante la cirugía, mátela humanamente por decapitación. Otro desafío es determinar las concentraciones de anticuerpos más efectivas para la inmunotinción de montaje completo. Al determinar las concentraciones de anticuerpos apropiadas, use la literatura publicada como punto de partida y optimice el protocolo, ya que el uso de reactivos publicados en diferentes tejidos (especialmente en tejidos más grandes o animales más viejos) puede requerir mayores concentraciones y / o tiempos de incubación.

La principal limitación de este método es el tiempo que un solo experimento toma de principio a fin y el número de peces que se pueden estudiar en un momento dado. Por ejemplo, todos los datos mostrados en la Figura 3 tardaron aproximadamente un mes desde el emparejamiento inicial de los peces hasta la recopilación y el análisis final de los datos. Este enfoque de rendimiento relativamente bajo podría complementarse con enfoques genéticos heterólogos que silencian selectivamente la actividad neuronal en el sistema visual^32,33 o por mutantes que carecen de axones RGC o actividad^34,35.

La importancia de este método es que aporta una técnica embriológica tradicional a las líneas de peces transgénicos modernas, permitiendo la comparación directa de los mecanismos celulares y genéticos que operan en cada uno de los lóbulos tectales dentro del mismo individuo. Además, este método está maduro para su aplicación a otros sistemas experimentales, incluidos los peces de superficie Astyanax ³⁶ y / o larvas transgénicas de pez cebra con microglia marcada fluorescentemente 37,38,39 y astrocitos ⁴⁰ para estudiar cómo el sistema nervioso de los peces en desarrollo responde a una lesión tan dramática.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions.
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains.			Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.