Estandarización y mantenimiento de cultivos de organoides hepáticos e intestinales caninos en 3D para su uso en investigación biomédica

Summary

Se describen métodos experimentales para cosechar células madre adultas de tejidos intestinales y hepáticos caninos para establecer cultivos de organoides en 3D. Además, se discuten las técnicas de laboratorio para garantizar un crecimiento constante y proporcionar procedimientos operativos estándar para cosechar, biobancar y revivir cultivos de organoides intestinales y hepáticos caninos.

Abstract

Los perros desarrollan enfermedades multifactoriales complejas análogas a los humanos, incluidas las enfermedades inflamatorias, las enfermedades metabólicas y el cáncer. Por lo tanto, representan modelos animales grandes relevantes con el potencial de traslación a la medicina humana. Los organoides son estructuras 3-dimensionales (3D), autoensambladas derivadas de células madre que imitan la microanatomía y la fisiología de su órgano de origen. Estos modelos traslacionales in vitro se pueden utilizar para aplicaciones de permeabilidad y descubrimiento de fármacos, evaluación toxicológica y para proporcionar una comprensión mecanicista de la fisiopatología de las enfermedades crónicas multifactoriales. Además, los organoides caninos pueden mejorar la vida de los perros de compañía, proporcionando información en diversas áreas de la investigación veterinaria y facilitando aplicaciones de tratamiento personalizado en medicina veterinaria. Un pequeño grupo de donantes puede crear un biobanco de muestras de organoides, reduciendo la necesidad de una recolección continua de tejido, ya que las líneas celulares organoides se pueden subcultivar indefinidamente. A continuación, se presentan tres protocolos que se centran en el cultivo de organoides caninos intestinales y hepáticos derivados de células madre adultas. El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos describe métodos para procesar el tejido y la incrustación del aislado celular en una matriz de soporte (matriz de membrana extracelular solubilizada). El Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos describe el crecimiento y mantenimiento de organoides, incluida la limpieza y el paso junto con el momento adecuado para la expansión. El Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides describe formas de extraer, congelar y preservar organoides para su posterior análisis.

Introduction

Los roedores son el modelo animal más utilizado para la investigación biomédica y ^{traslacional1}. Son excepcionalmente útiles para investigar la patogénesis molecular básica de las enfermedades, aunque recientemente se ha cuestionado su relevancia clínica para las enfermedades multifactoriales ^crónicas2. El modelo canino exhibe varias ventajas en comparación con los ^roedores3,4. Perros y humanos comparten similitudes en metabolómica y microbioma intestinal que se desarrolló debido al consumo de dieta humana a lo largo de varios períodos de su domesticación5,6,7. Las similitudes entre la anatomía y fisiología gastrointestinal canina y humana es otro de los ^ejemplos8.

Además, los perros a menudo comparten entornos y estilos de vida similares con sus ^dueños9. La mayor esperanza de vida de los perros en comparación con los roedores permite el desarrollo natural de numerosas afecciones ^crónicas10. La enfermedad inflamatoria intestinal o el síndrome metabólico son ejemplos de enfermedades crónicas multifactoriales que comparten importantes similitudes entre humanos y ^perros11,12. Los ensayos preclínicos caninos que involucran a perros con enfermedades naturales pueden generar datos más confiables que los obtenidos de modelos de ^roedores13. Sin embargo, para minimizar el uso de la investigación con animales vivos y cumplir con los principios de las 3R (Reduce, Refine, Replace)¹⁴, han surgido alternativas a las pruebas in vivo utilizando organoides caninos 3D in ^vitro15.

Los organoides son estructuras derivadas de células madre 3D autoensambladas que recapitulan la fisiología y la microanatomía de sus órganos ^{originales16,17}. Esta tecnología fue descrita por primera vez por Sato et al. en 200917 y permitió realizar más estudios in vitro traducibles en líneas celulares epiteliales de lo que era posible anteriormente utilizando cultivos de células cancerosas 2D18,19,20. Los organoides son modelos in vitro útiles en muchas disciplinas biomédicas como en estudios toxicológicos preclínicos21,22,23, de absorción o metabolismo24,25,26,27,28, así como en enfoques médicos personalizados29,30,31 . El cultivo exitoso de organoides intestinales caninos se ha descrito por primera vez en 201912, mientras que los organoides hepáticos derivados de un perro fueron reportados por primera vez por Nantasanti et al. en 201532. Desde entonces, los organoides caninos se han utilizado con éxito en estudios que investigan enteropatías crónicas caninas, tumores del estroma gastrointestinal, adenocarcinoma ^{colorrectal12} y enfermedad de ^Wilson33,34.

Si bien las células madre adultas se pueden cosechar a través de necropsias, la tecnología organoide no siempre requiere el sacrificio de los animales. Las biopsias endoscópicas y laparoscópicas, o incluso los aspirados con aguja fina de ^órganos35, son una fuente viable de células madre adultas para el aislamiento de organoides epiteliales12. El uso generalizado de estas técnicas no invasivas en la práctica veterinaria facilita las opciones para la investigación traslacional inversa (traducción de la información de la práctica clínica veterinaria a la práctica clínica humana y viceversa)¹⁵. Se puede garantizar un mayor avance de la tecnología de organoides mediante la estandarización de los métodos de cultivo y mantenimiento de organoides. El protocolo organoide presentado aquí se basa parcialmente en el trabajo publicado previamente de Saxena et al. de ²⁰¹⁵³⁶, y los métodos se adaptaron para adaptarse a los detalles del cultivo de organoides intestinales y hepáticos caninos. El flujo de trabajo general de los protocolos de organoides caninos se representa en la Figura 1.

El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos introduce métodos para obtener muestras de biopsias endoscópicas, laparoscópicas y quirúrgicas, así como necropsias. Describe el pretratamiento inicial de las muestras de tejido y las metodologías utilizadas para el transporte al laboratorio. Los materiales y reactivos necesarios para el aislamiento de organoides se resumen en la sección “Preparación para el aislamiento”. El proceso de aislamiento de células madre adultas a partir de muestras de tejido se describe con más detalle. Finalmente, se discute el proceso de recubrimiento de organoides en estructuras en forma de cúpula utilizando una matriz de membrana extracelular solubilizada.

El segundo protocolo, el Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos, describe los métodos de documentación y cultivo de organoides. Los cambios en los medios y su frecuencia se analizan en esta sección. Además, se describen los procedimientos de laboratorio como el pasaje y la limpieza de los cultivos celulares, que son esenciales para garantizar el mantenimiento exitoso de los organoides caninos 3D. El paso apropiado es un paso crítico del protocolo, y los posibles ajustes y la solución de problemas de este paso se discuten más a fondo en el manuscrito.

El último protocolo es el Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides Caninos que contiene métodos para preparar organoides adultos para la incrustación de parafina y la preservación del ARN. Los métodos de biobanco de muestras de organoides en el almacenamiento de nitrógeno líquido también se describen aquí. Finalmente, se discuten las formas de descongelar las muestras congeladas y apoyar su crecimiento.

En conclusión, este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos consistentes de cultivo de organoides caninos a través de la estandarización de protocolos entre laboratorios. Al hacerlo, el manuscrito tiene como objetivo facilitar la reproducibilidad de los datos derivados de modelos organoides caninos para aumentar su relevancia en la investigación biomédica traslacional.

Figura 1: Flujo de trabajo de protocolos organoides caninos. El Protocolo de Aislamiento de Organoides Caninos describe la preparación de los materiales necesarios para el aislamiento de organoides, la recolección de una muestra de tejido (a través de necropsias, biopsias endoscópicas, laparoscópicas y quirúrgicas) y la orientación sobre la disociación celular y el recubrimiento de la población celular. El Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos discute la limpieza y el pasaje del cultivo de organoides. El Protocolo de Sustracción y Biobanco de Organoides discute la preparación de muestras de organoides para la incrustación de parafina y la caracterización adicional de organoides. También se discuten los métodos para biobancar cultivos de organoides y revivirlos del almacenamiento en nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

La investigación fue aprobada y realizada de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). NOTA: La siguiente sección (pasos 1-3) describe el Protocolo de aislamiento de organoides caninos. 1. Preparación para el aislamiento Tubos de transporte: Antes del aislamiento organoide (típicamente 24 h antes), llene un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de mezcla media/nutriente Eagle modificada F-12 (Advanced DMEM/F12) de Dulbecco enriquecida con 0,2 ml de pen strep. Para biopsias laparoscópicas, incisionales o por escisión, prepare tres tubos cónicos adicionales de 50 ml. Llene estos tubos con 10 ml de solución quelante completa (1x CCS; ver Tabla 1).NOTA: Para el paso 1.2, 2 mM de N-acetilcisteína (NAC) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) también se puede utilizar como una solución tradicional utilizada para la recolección de células madre. No se observaron diferencias al usar 1x CCS o NAC en PBS. Ambas soluciones se agregan para liberar celdas en la solución. Mantenga los tubos a 4 °C durante la noche y transporte los tubos en hielo durante el resto del protocolo. Prepare cinco tubos centrífugos de 15 ml con 5 ml de 1x CCS, un tubo centrífugo de 15 ml con 3 ml de 1x CCS, un tubo centrífugo vacío de 15 ml (tubo sobrenadante) y un tubo centrífugo de 15 ml con 5 ml de 1x CCS y 2 ml de suero fetal bovino (FBS).NOTA: Lo anterior se puede preparar antes del día del aislamiento si se procesarán varias muestras. Para obtener ilustraciones, consulte el diseño del tubo de aislamiento en la Figura 2. El día del aislamiento, prepare una placa de Petri, bisturí, cubo de hielo y DMEM / F12 avanzado frío en el gabinete de bioseguridad. Coloque el número requerido de placas de cultivo celular de 24 pocillos en la incubadora (37 °C; atmósfera de CO2 al 5%) para precalentarlas. Coloque la matriz de membrana extracelular solubilizada (ECM; ver Tabla de materiales) en hielo para comenzar la descongelación.NOTA: La inmersión en hielo protege contra la descongelación rápida y ayuda a evitar la solidificación. Se puede colocar una caja de puntas de pipeta en el congelador para ayudar a enchapar el ECM solubilizado. Prechill una centrífuga a 4 °C. Mueva el medio completo con factores de crecimiento “CMGF+” o “medios organoides” (consulte la Tabla 1 para la composición) del congelador/refrigerador a un baño de agua a 37 °C. Evite la exposición directa a la luz cuando sea posible. Figura 2: Diseño del tubo de aislamiento. La configuración recomendada para la recolección de tejidos incluye 10 ml de DMEM/F12 avanzado y 0,2 ml de estreptococo en pluma en un tubo centrífugo de 50 ml. Además, se requieren tres tubos de 50 ml llenos de 10 ml de 1x CCS para biopsias quirúrgicas o necropsias. El diseño de tubo recomendado para los pasos de aislamiento incluye cinco tubos que contienen 5 ml de 1x CCS para ser utilizados durante los pasos de lavado de CCS. El primer tubo se utiliza como un tubo de muestra que contiene el tejido picado, y los tubos restantes sirven como reservorios de 1x CCS que se agregará al primer tubo. El sexto tubo contiene 3 ml de 1x CCS para enjuagar el tejido restante del tubo de muestra cuando se transfiere a una placa de 6 pocillos. Estos seis tubos se utilizarán antes de la etapa de incubación de EDTA. Un tubo con 5 mL de 1x CCS y 2 mL de FBS sirve como tubo de muestra después de la incubación de EDTA, y el sobrenadante de este tubo se transfiere con células madre a un tubo vacío durante el resto del aislamiento. Mantenga los tubos a 4 °C antes de comenzar el aislamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Recolección de tejidos Las biopsias endoscópicas intestinales y laparoscópicas (diámetro 2,8 mm) se pueden adquirir utilizando fórceps de biopsia grandes. Cosechar al menos ocho muestras endoscópicas por sitio intestinal. Recoger muestras directamente en tubos de transporte y colocarlas sobre hielo. Para biopsias quirúrgicas y necropsias, recolecte piezas de tejido con un tamaño de 0,5 cm x 0,5 cm y colóquelas en el primer tubo 1x CCS.NOTA: Para biopsias intestinales, elimine cualquier contenido intestinal restante y raspe la capa mucosa con un bisturí para eliminar las vellosidades. Si las muestras son abundantes, se pueden recolectar biopsias adicionales en crioviales que contienen reactivo de almacenamiento de ARN (1 ml) o incrustado en parafina para futuras comparaciones entre organoides y su tejido de origen. En el caso de tomar biopsias para el análisis TEM, no raspar las vellosidades y almacenar la muestra en conservante (3% de paraformaldehído y 3% de glutaraldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y almacenar a 4 °C. Agite el tubo 1x CCS vigorosamente durante ~ 30 s, y luego transfiera la muestra a un nuevo tubo 1x CCS usando fórceps. Repita este proceso dos veces. Transfiera la muestra del último tubo 1x CCS al tubo de transporte (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) y lleve la muestra de vuelta al laboratorio.NOTA: Las muestras pretratadas de esta manera también se pueden enviar durante la noche en hielo (no enviar en hielo seco). 3. Aislamiento de organoides NOTA: Realice el aislamiento utilizando técnicas asépticas en un gabinete de bioseguridad. Consulte la Figura 3 para el flujo de trabajo de aislamiento de organoides caninos. Agite la muestra de tejido en el tubo de transporte durante ~ 30 s y retire el sobrenadante excesivo hasta que queden 0,5 ml en el tubo mediante el pipeteo lento cerca de la superficie del fluido. Asegúrese de no desechar ningún tejido. Transfiera el tejido y el sobrenadante restante a una placa de Petri estéril. Usando un bisturí desechable (o pinzas y tijeras esterilizadas), corte y pica el tejido en trozos más pequeños (tamaño de 1 mm2) que se asemejen a una consistencia de puré durante aproximadamente 5 minutos. Pipetear el tejido picado con líquido desde la placa de Petri hasta el primer tubo CCS. Agregue 2 ml de DmEM/F12 avanzado a la placa de Petri, enjuague el tejido restante y transfiéralo al primer tubo CCS. Vórtice el tubo 1x CCS durante 5 s aproximadamente cinco veces. Permita que las biopsias se asienten en la parte inferior del tubo de 15 ml (aproximadamente 1 min) y retire el sobrenadante hasta que queden 5 ml en el tubo. Transfiera el 1x CCS del nuevo tubo al tubo de muestra. Repita el paso anterior para los dos tubos siguientes. En los dos últimos lavados, retire el sobrenadante hasta 3 ml restantes en el tubo. Transfiera las biopsias y 1x CCS del tubo de muestra a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Luego, agregue 3 ml de 1x CCS al tubo de muestra, gire suavemente para recolectar cualquier tejido restante y transfiéralo al mismo pozo de la placa. Añadir 150 μL de 0,5 M de EDTA (para lograr un volumen total de 6,15 mL en un pozo). Coloque la placa de 6 pocillos en un mezclador/balancín nutating de 20° y 24 rpm a 4 °C. Incubar las muestras de hígado durante 10 min y las muestras intestinales durante 1 h en el balancín móvil. Transporte la placa de 6 pocillos de vuelta al gabinete de bioseguridad. Transfiera el tejido picado y el líquido a un tubo CCS / FBS 1x y permita que los tejidos se asienten. Transportar el sobrenadante (esta porción ahora incluye células madre libres) y aproximadamente 0,2 ml de la parte superior del tejido al tubo vacío. Gire hacia abajo el tubo que contiene la muestra (700 x g durante 5 min a 4 °C). Las células madre ahora se peletizan junto con el tejido picado. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado para no molestar el pellet. Vuelva a suspender el pellet en Advanced DMEM/F12 y vuelva a girar el tubo (700 x g durante 5 min a 4 °C). Aspire el sobrenadante y no moleste el pellet. Calcule el volumen de ECM solubilizado necesario para sembrar las células y tejidos disociados. Use 30 μL de ECM solubilizado por pocillo de una placa de 24 pocillos para lograr la densidad de siembra adecuada.NOTA: Inserte una muestra después del aislamiento en 4 a 6 pocillos de una placa de 24 pocillos (es decir, según la cantidad de tejido picado en la muestra). Agregue el volumen calculado de ECM solubilizado al tubo de muestra y pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo para evitar la formación de burbujas. Sembra la suspensión en el medio de los pozos para que el ECM solubilizado pueda formar una estructura en forma de cúpula.NOTA: El uso de puntas de pipeta de un congelador de -20 °C ayuda a enchapar ecm solubilizado. Si los trozos de tejido son más grandes que la punta de la pipeta P200, use puntas frías anchas o puntas P1000 frías cortadas para ayudar en el revestimiento. Mantenga la muestra con el ECM solubilizado en hielo siempre que sea posible. Transporta la placa a una incubadora (37 °C; 5% atmósfera de CO2 ) y deja que el ECM solubilizado se solidifique durante ~30 min. Mezclar inhibidor de ROCK y GSK3β en CMGF+ (concentraciones en la Tabla 1). Añadir 500 μL de esta solución (CMGF+ R/G) a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C; 5% de atmósfera de CO2 ). Figura 3: Flujo de trabajo de aislamiento de organoides caninos. La muestra de tejido cosechada se transfiere a una placa de Petri y se pica adecuadamente. Luego, la muestra se transfiere a un tubo 1x CCS y se realizan los pasos de lavado. Para la incubación de EDTA en una placa de 6 pocillos, la muestra se transfiere a un tubo que contiene 1x CCS y FBS. Después de que el tejido se asienta, el sobrenadante con una pequeña cantidad de tejido se transfiere a un tubo vacío. En consecuencia, la muestra se hila, se retira el sobrenadante y se vuelve a suspender el pellet en Advanced DMEM/F12. El tubo se gira de nuevo, y el sobrenadante se aspira y se descarta. El ECM solubilizado se agrega al tubo, se mezcla y la muestra se enchapa en una placa de 24 pocillos. En consecuencia, la placa se incuba (37 °C; 5% de atmósfera de CO2 ) durante 30 min, y luego se agrega el medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. NOTA: La siguiente sección (pasos 4 y 5) describe el Protocolo de Mantenimiento de Organoides Caninos. Cambie los medios de acuerdo con la Tabla 2 y revise los organoides diariamente para detectar signos de apoptosis, contaminación, hacinamiento y desprendimiento de ECM solubilizada. Se deben tomar notas diarias de acuerdo con la Figura 4 para monitorear con precisión las condiciones y los efectos experimentales en los cultivos. Consulte la Tabla suplementaria 1 para obtener una plantilla que permita tomar notas precisas y reproducibles relacionadas con el cultivo de organoides. Para los organoides hepáticos, use CMGF+ mejorado con inhibidor de ROCK y GSK3β. Figura 4: Guía de tamaño y densidad de organoides. (A) Tabla de tamaño de organoides para un seguimiento preciso del crecimiento de organoides. La Guía de dimensionamiento incluye categorías extrapequeña (XS), pequeña (S), mediana (M), grande (L) y extragrande (XL). (B) La Guía de Densidad consiste en categorías de muy baja densidad (VLD), baja densidad (LD), densidad media (MD), alta densidad (HD) y muy alta densidad (VHD). (C) Imágenes representativas de la contaminación bacteriana y fúngica de la muestra de organoides. D) Imágenes representativas de hacinamiento organoide y apoptosis. La ampliación objetiva se indica en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Recomendación de cambio de medios Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo 500 μL N/A 500 μL N/A 750 μL N/A N/A Tabla 2: Recomendación de cambio de medios. Una línea de tiempo recomendada de cambio semanal de medios. Se recomienda cambiar los medios (500 μL de CMGF+ para organoides intestinales, o 500 μL de CMGF+ R/G para organoides hepáticos) cada dos días. Para tener en cuenta las horas adicionales en un fin de semana, se agregan 750 μL de medios los viernes por la tarde, y los medios se actualizan los lunes por la mañana. 4. Limpieza de organoides NOTA: La limpieza o el pasaje de organoides deben realizarse regularmente para mantener la salud del cultivo de organoides. Realizar el procedimiento de limpieza siempre que se note apoptosis en el cultivo, presencia de escombros, hacinamiento de los organoides, o desprendimiento de ECM solubilizada. Consulte la Figura 4D. Retire el medio de los pocillos mientras inclina la placa para evitar la destrucción de la ECM solubilizada.NOTA: Si el desprendimiento de ECM solubilizado es considerable, se aconseja transferir el medio al tubo de 15 ml para evitar la pérdida de fragmentos de ECM solubilizado que contienen la muestra. Agregue 0,5 ml de DMEM/F12 avanzado preenrollado a cada pozo para disolver las cúpulas de la matriz mediante pipeteo repetido con una punta P1000 (evite crear burbujas excesivas). Transfiera la matriz disuelta que contiene organoides a un tubo centrífugo de 15 ml. Mantenga el tubo en hielo y si el volumen es inferior a 6 ml, llene lentamente el tubo con Advanced DMEM / F12 para alcanzar un volumen total de 6 ml. Gire el tubo (700 x g durante 5 min a 4 °C) y retire todo el sobrenadante mientras se asegura de no molestar el pellet. Agregue el volumen requerido de ECM solubilizado (30 μL por pocillo para lograr la densidad de siembra adecuada) y resuspenda lentamente el pellet mediante la mezcla de pipetas. Coloque la suspensión en el medio de la placa de 24 pocillos para formar una cúpula. Coloque la placa en una incubadora (37 °C; atmósfera de CO2 al 5%) durante ~ 30 min, y luego agregue el volumen apropiado de medios (Tabla 2). 5. Paseo organoide NOTA: El pasaje se realiza típicamente 5-7 días después del cultivo inicial para expandir la línea celular organoide. Los cultivos de organoides generalmente se pueden expandir en una proporción de 1: 3. Las imágenes de culturas sanas listas para el paso se pueden ver en la Figura 4. Los organoides tienen que ser al menos de tamaño mediano. Realice los pasos 4.1 a 4.3. Retire el sobrenadante dejando 0,5 ml en el tubo. Asegúrese de no molestar el pellet. Añadir 0,5 ml de proteasa similar a la tripsina (ver Tabla de Materiales), mezclar adecuadamente aspirando con una pipeta e incubar en el baño de agua a 37 °C (incubar organoides intestinales durante 8 min o organoides hepáticos durante 10 min). Continúe mezclando la solución moviendo el tubo varias veces en el punto medio de la incubación. Mueva el tubo que contiene la muestra de nuevo a un gabinete de bioseguridad y agregue lentamente 6 ml de DMEM/ F12 avanzado preclasificado para inactivar la proteasa similar a la tripsina y detener la disociación de las células. Gire el tubo (700 x g durante 5 min a 4 °C) y retire el sobrenadante. Asegúrese de no molestar el pellet. Realice los pasos 4.4. y 4.5.NOTA: La siguiente sección (pasos 6-9) describe la sustracción de organoides y el protocolo de biobancos. Los cultivos de organoides tienen que estar libres de tejido que se ha eliminado durante pasajes anteriores. Los cultivos también deben ser saludables, al menos grandes en tamaño, y de densidad media a alta. Las imágenes de cultivos saludables listos para aplicaciones posteriores se pueden ver en la Figura 4. Moverse aguas abajo con la preservación y recolección de cultivos de organoides subóptimos puede afectar negativamente los resultados de la caracterización y la viabilidad del biobanco. Revise el diseño de placa de 24 pocillos recomendado en la Figura 5. Figura 5: Diseño recomendado de placa de 24 pocillos. El diseño recomendado de la placa de 24 pocillos para la caracterización básica después de la expansión del cultivo de organoides. La incrustación de parafina de seis pocillos (organoides medianos a grandes de densidad media a alta) generalmente permitirá una alta concentración de organoides en un bloque histológico. Cuatro pocillos de organoides se pueden agrupar en uno criovial con reactivo de almacenamiento de ARN para aplicaciones posteriores. Catorce pozos se utilizan para biobancar las muestras de organoides y proporcionan material para hasta siete viales criopreservados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Fijación de organoides Retire los medios del pozo y asegúrese de no perturbar la cúpula de ECM solubilizada. Añadir 500 μL de solución de formalina-ácido acético-alcohol que sirva como fijador (FAA; composición en la Tabla 1). Guarde los organoides a temperatura ambiente. Después de 24 h, aspire FAA y llene el pozo con etanol al 70%. Envuelva las placas con una cinta de película flexible de laboratorio (consulte la Tabla de materiales) para evitar la evaporación rápida. Los organoides ahora están listos para la incrustación de parafina. La incrustación de parafina del cultivo organoide se realiza en moldes de base metálica tradicionales. 7. Preservación del ARN Retire los medios de los pozos y asegúrese de no perturbar la cúpula de ECM solubilizada. Utilice 0,5 ml de DMEM/F12 avanzado preclasado por pozo para disolver las cúpulas de ECM solubilizadas mediante pipeteos repetidos hacia arriba y hacia abajo (evite crear burbujas excesivas). Transfiera los organoides a un tubo centrífugo de 15 ml. Mantenga el tubo en hielo y si el volumen es inferior a 6 ml, llene lentamente el tubo con Advanced DMEM / F12 para alcanzar los 6 ml de volumen total. Gire el tubo (700 x g durante 5 min a 4 °C) y retire todo el sobrenadante. Asegúrese de no molestar el pellet. Agregue 100 μL de PBS al tubo de muestra y vuelva a suspender el pellet mediante pipeteo suave. Transfiera el contenido del tubo de muestra a un criovial. Agregue 900 μL de reactivo de almacenamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales) al tubo de muestra y mezcle para recolectar los organoides restantes. Transfiera estos organoides residuales al criovial y guárdelos a -80 ° C (generalmente cuatro pocillos agrupados en un criovial serán suficientes para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de qPCR y ARN).NOTA: Un criovial típicamente produce un total de 4.000 ng de ARN (medido a través del análisis espectrofotómetro). 8. Biobanco de organoides NOTA: Los biobancos generalmente ocurren 3-4 días después del pasaje. Los signos de apoptosis no deben estar presentes en el cultivo para realizar este método. Consulte la Figura 4 para hacer referencia al tamaño y la densidad apropiados para la congelación. Biobanco de organoides medianos a extragrandes a densidades medias a muy altas. Se puede seguir un paso de congelación de emergencia si una línea celular organoide es especialmente rara o no se garantiza una mayor viabilidad. Siga los mismos pasos para los biobancos organoides normales (pasos 8.1 a 8.4). La congelación de emergencia se realiza con cultivos más pequeños y menos densos. Agrupa tantos pocillos de organoides en crecimiento en uno criovial siguiendo los pasos 8.1 a 8.4. Tenga en cuenta que se debe mantener vivo un número suficiente de organoides en un intento de expandir el cultivo (la congelación de emergencia es simplemente un procedimiento de respaldo para proteger contra la posible pérdida de cultivo a través de la contaminación u otros sucesos inesperados). Siga los pasos 7.1 a 7.3. Agregue 1 ml de medio de congelación por criovial (composición en la Tabla 1) al tubo de muestra y resuspenda suavemente el pellet mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Transfiera 1 ml de la solución a un criovial (proporción de dos pocillos/criovial) y mantenga los crioviales en hielo. Transfiera los crioviales del hielo a un recipiente de congelación (rellene regularmente el depósito con isopropanol) y transfiera inmediatamente a -80 ° C. Mueva las muestras a nitrógeno líquido (-196 °C) para su almacenamiento a largo plazo después de 24 h.NOTA: También se puede usar un recipiente de congelación celular sin alcohol en lugar de uno tradicional. Asegúrese de que las muestras no se descongelen durante el transporte desde los -80 °C hasta el almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo. La descongelación repetida disminuye la viabilidad del cultivo celular. 9. Renacimiento del almacenamiento de nitrógeno líquido NOTA: Al elegir descongelar una línea organoide, un subconjunto de los organoides revividos debe ser recongelado y reemplazado en el biobanco lo más rápido posible con al menos uno (preferiblemente más) crioviales. Coloque el ECM solubilizado en hielo para descongelar lentamente, coloque una placa de 24 pocillos en la incubadora (37 ° C; atmósfera de CO2 al 5%) y prepare los reactivos necesarios, como un tubo de 15 ml y Advanced DMEM / F12. Recupere una muestra criovial que contiene una muestra de organoides del almacenamiento de nitrógeno líquido y transfiérala inmediatamente a un baño de calor (37 °C) durante 2 min. Transfiera el contenido del criovial a un tubo centrífugo de 15 ml en un gabinete de bioseguridad. Agregue lentamente DMEM/ F12 avanzado prechileado para alcanzar un volumen total de 6 ml. Girar el tubo (700 x g durante 5 min a 4 °C). Retire el sobrenadante y asegúrese de no molestar el pellet. Agregue 180 μL (30 μL por pocillo) de ECM solubilizado al pellet y coloque esta suspensión en la placa precalentada de 24 pocillos. Un criovial se puede enchapar en seis pocillos de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos en la incubadora (37 °C; atmósfera de CO2 al 5%) durante ~ 30 min y agregue CMGF + R / G (para organoides intestinales, cambie a CMGF + en 24 a 48 h).NOTA: Cuando una muestra se enchapa y crece en la placa de 24 pocillos, se debe permitir que se recupere durante al menos 2 días antes de pasar para aumentar la viabilidad.

Representative Results

El protocolo de organoides caninos generalmente genera ~ 50,000 a ~ 150,000 células intestinales o hepáticas por pocillo de una placa de 24 pocillos. Los organoides representativos se pueden ver en la Figura 6. Figura 6: Imágenes representativas de organoides caninos. Se representan imágenes de organoides aislados utilizando este protocolo. (A,B) Organoides intestinales derivados del duodeno (tomados a 10x y 5x aumento objetivo). Tenga en cuenta la presencia de organoides más viejos y esferoides más jóvenes. (C,D) Enteroides caninos de la porción inferior del yeyuno (tomados a un aumento objetivo de 10x y 20x). (E,F) Enteroides ileales (tomados a un aumento objetivo de 20x y 5x) y colonoides (G, H) (tomados a un aumento objetivo de 10x). (I) Una imagen representativa de organoides hepáticos tomada a un aumento objetivo de 20x. La mayoría de los organoides están en su forma incipiente. Los esferoides hepáticos más jóvenes también se pueden ver en la imagen. (J) Imagen representativa que muestra un organoide rarehepático que forma una estructura similar a un conducto (tomada a un aumento objetivo de 10x). La barra de escala (500 μm) está presente en la esquina superior izquierda de cada imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los enteroides y colonoides derivados de este protocolo fueron caracterizados previamente por Chandra et al. en 201912. Los organoides intestinales caninos están compuestos por una población celular regular del epitelio intestinal. Utilizando la hibridación in situ de ARN, la expresión de biomarcadores de células madre (Repetición rica en leucina que contiene el receptor acoplado a la proteína G 5 – LGR5 y el factor de transcripción SRY-Box 9 – SOX9), el biomarcador de células de Paneth (receptor tipo B de efrina 2 – EPHB2), los marcadores de células epiteliales absorbentes (fosfatasa alcalina – ALP) y el marcador enteroendocrino (Neurogenina-3 – Neuro G3)12 se confirmó. La tinción de alcian Blue se realizó en diapositivas incrustadas en parafina para confirmar la presencia de células caliciformes. Además, se realizaron ensayos funcionales como imágenes metabólicas ópticas (OMI) o el ensayo de hinchazón del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) para confirmar la actividad metabólica de los organoides. También se aislaron organoides caninos de perros diagnosticados de enfermedad inflamatoria intestinal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST) o adenocarcinoma colorrectal mediante este protocolo12. Después del aislamiento de células madre, los organoides caninos hepáticos comienzan su ciclo de vida como esferoides en expansión, y después de ~ 7 días, se convierten en organoides en ciernes y diferenciadores. Se midieron esferoides hepáticos caninos aislados y cultivados según este protocolo para cuantificar su crecimiento y determinar el momento ideal para el paso. Los esferoides derivados de biopsias hepáticas laparoscópicas de perros adultos sanos (n = 7) se midieron durante sus primeros 7 días de cultivo. Se tomaron imágenes representativas y se midió el radio longitudinal (a) y diagonal (b) de los esferoides (n = 845) en todo el cultivo. Se calcularon el volumen (V), el área de superficie (P), el área de elipse 2D (A) y la circunferencia (C) de los esferoides. Los cálculos y resultados del experimento se resumen en la Figura 7. Se utilizó el área de elipse 2D y la circunferencia para evaluar la salud del cultivo de organoides mediante microscopía de luz. Estos valores pueden servir como guía para las decisiones de mantenimiento de la cultura. Brevemente, los esferoides se expandieron rápidamente en volumen, área de superficie, área de elipse 2D y circunferencia. Los datos de medición de los siete beagles se promediaron para los siguientes cálculos. El volumen aumentó en un 479% (±6%) del día 2 al 3. Al mismo tiempo, el área de superficie de esferoides y el área de elipse 2D aumentaron en un 211% (±208%) y 209% (±198%), respectivamente. La circunferencia de la elipse 2D aumentó del día 2 al 3 en un 73% (±57%). El aumento en el volumen total de organoides hepáticos de los días 2-7 fue de más de 365 veces, el área de superficie y el área de elipse 2D aumentó 49 veces, y la circunferencia de la elipse 2D aumentó seis veces. A continuación, los esferoides derivados de dos muestras caninas adultas se cultivaron después del paso y se recolectaron todos los días (día 2-7) para la hibridación in situ de ARN (ARN ISH). Se diseñaron sondas caninas (la lista de sondas se proporciona como Tabla suplementaria 2), y se evaluó la expresión de ARNm para marcadores de células madre (LGR5), marcadores específicos para colangiocitos (citoqueratina 7 – KRT-7 y acuaporina 1 – AQP1), así como marcadores de hepatocitos (proteína de caja de horquilla A1 – FOXA1; y citocromo P450 3A12 – CYP3A12). La expresión de los marcadores se evaluó de manera semicuantitativa (imágenes representativas en la Figura 8). Los esferoides expresaron preferentemente el marcador de colangiocitos KRT-7 que va del 1% al 26% en el área de señal / área total de las células. AQP1 no se expresó en las muestras de organoides, posiblemente porque su presencia en muestras hepáticas caninas es escasa. La expresión del marcador de células madre (LGR5) osciló entre 0,17% y 0,78%, mientras que los marcadores de hepatocitos se expresaron en menor medida en 0,05%-0,34% para FOXA1 y 0,03%-0,28% para CYP3A12. Figura 7: Mediciones de esferoides hepáticos. (A) El crecimiento de esferoides hepáticos se observó todos los días de cultivos desde el día 2-7. Los esferoides se formaron por primera vez el día 2, y los últimos esferoides comenzaron el proceso de brotación el día 7. Un experimento posterior utilizó dos líneas organoides caninas después del paso para cosechar esferoides todos los días para la incrustación de parafina para realizar ISH de ARN (la imagen del día 2 se tomó a 40x, la imagen del día 6 a 10x, y el resto de las imágenes se tomaron a un aumento de 20x). (B) Se muestra un grupo de esferoides hepáticos unido a un trozo de tejido incrustado en ECM solubilizado 4 días después del aislamiento. Se midieron los radios longitudinales y diagonales de los esferoides (imagen tomada a 10x). El panel (C) representa la fórmula utilizada para los cálculos para derivar el volumen (V), el área de superficie (P), el área de elipse 2D (A) y la circunferencia (C). Para estos cálculos, se presumió que los esferoides hepáticos caninos son esferoides ideales. Los resultados de las mediciones del volumen de los esferoides hepáticos, el área de superficie, el área de elipse 2D y la circunferencia de elipse 2D para días individuales de crecimiento se representan en el panel (D). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). (E) la expresión de ARNm de KRT-7, LGR5, FOXA1 y CYP3A12 se midió en muestras de esferoides hepáticos caninos después del paso del día 2 al día 7. AQP1 no se expresó en estas muestras. Una barra de escala (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) está presente en la parte superior izquierda de cada imagen. Aumento objetivo observado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los organoides rara vez no se romperían durante el proceso de paso después de esta técnica estandarizada. Si no se produce la disociación, los tiempos de paso se pueden ajustar para lograr una desintegración óptima del grupo celular. Sin embargo, la exposición prolongada a la proteasa similar a la tripsina puede afectar negativamente el crecimiento de los organoides. Los organoides hepáticos se utilizaron en un experimento posterior para investigar el tiempo óptimo de disociación y establecer un método de pase adecuado. Brevemente, los organoides hepáticos de dos perros sanos (6 réplicas de pozos cada uno) se pasaron con proteasa similar a la tripsina durante 12 minutos y 24 minutos. Las muestras se agitaron cada 6 min. Al final del punto de tiempo de disociación, se agregaron 6 ml de DMEM/F12 avanzado helado a la solución y se hicieron girar muestras (700 x g durante 5 min a 4 °C). Se eliminó el sobrenadante (DMEM avanzado /F12 con proteasa diluida similar a la tripsina) y los gránulos se incrustaron en ECM solubilizada como se describió anteriormente (pasos 4.4-4.5). Después de 12 h de cultivo en ECM solubilizada y CMGF+ R/G, se observaron diferencias en ambas muestras. Una incubación de 12 minutos con proteasa similar a la tripsina no inhibió el crecimiento de organoides. Sin embargo, el crecimiento de los organoides se vio afectado negativamente (ver Figura 9) utilizando una incubación de 24 minutos. Figura 9: Experimento de paso organoide hepático canino. Imágenes representativas de organoides derivados de dos perros (D_1 y D_2) pasando utilizando el método de incubación de proteasa similar a la tripsina durante 12 min o 24 min. Las muestras de control se pasaron con proteasa similar a la tripsina durante 10 min. Una barra de escala (μm) está presente en la parte superior izquierda de cada imagen y representa 500 μm (aumento objetivo 5x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. A continuación, se realizó la investigación sobre la supervivencia de los organoides hepáticos caninos derivados de este protocolo en un ambiente desfavorable (privación de soporte estructural y nutrición). La investigación se centró en determinar el volumen de medios organoides y la matriz del basamento necesarios para el crecimiento y la supervivencia exitosos de los organoides hepáticos y también en establecer la influencia de tales condiciones en el cultivo de organoides. La capacidad de supervivencia se midió en una placa de 96 pocillos con un número limitado de organoides. Los organoides de dos perros se pasaron como se describió anteriormente y se incrustaron (12 réplicas) en diferentes volúmenes de ECM solubilizada (10 μL o 15 μL). Las células se enchaparon en una concentración de 400 células/10 μL de pozo y 600 células/15 μL de pozo correspondiente a 40.000 células/ml. Se agregaron dos tipos de medios (CMGF+, o CMGF+ R/G) en diferentes volúmenes (25 μL, 30 μL o 35 μL). Los medios de comunicación nunca se cambiaron, y no se realizaron procedimientos de mantenimiento. La capacidad de supervivencia de los organoides fue monitoreada todos los días. La muerte organoide se definió como la disolución de más del 50% de las estructuras organoides. La tasa de supervivencia de los organoides en estas condiciones varió de 12,9 (±2,3) días a 18 (±1,5) días, y los resultados se resumen en la Tabla 3. Las dos muestras que sobrevivieron más tiempo fueron organoides derivados de perros incrustados en 15 μL de ECM solubilizada y 30 μL de medios CMGF+. Ambas muestras se incrustaron en ECM solubilizada (30 μL) y medios frescos (500 μL) en una placa estándar de 24 pocillos después de 18 días de privación para garantizar que la expansión organoidea aún fuera posible (Figura 10). Tipo de medio Media (días vividos) Mediana CV% Media (días vividos) Mediana CV% Media (días vividos) Mediana CV% Media (días vividos) Mediana CV% Medios (μL) 30 25 35 30 ECM (μL) 10 10 10 15 D_1 CMGF+ R/G 12.50 13 11.57 12.83 13 4.50 11.83 11.5 12.91 12.08 13 12.46 CMGF+ 17.08 17 16.26 18.50 19 4.89 18.42 19 14.54 17.82 19 8.99 D_2 CMGF+ R/G 13.67 14 13.36 13.00 13 12.70 14.00 14.5 17.23 13.08 13 8.90 CMGF+ 15.50 15 18.56 17.50 18 10.48 17.50 19 20.89 17.00 17 14.41 TOTAL CMGF+ R/G 13.08 13 13.13 12.92 13 9.39 12.92 13 17.52 12.58 13 11.22 CMGF+ 16.29 16.5 17.69 18.00 18.5 8.35 17.96 19 17.65 17.43 17 11.70 muerte = más del 50% de la masa organoidea es inviable Tabla 3: Resultados del experimento de supervivencia. El experimento se basó en la privación del soporte estructural o la nutrición de dos cultivos de organoides. Los resultados incluyen la media, la mediana y la desviación estándar (CV%) de las concentraciones individuales de ECM solubilizada y media en perros individuales. Figura 10: Privación nutricional y estructural de organoides. Los organoides se volvieron a colocar en placas de 24 pocillos para confirmar la capacidad de expansión después de la privación (A). Las imágenes representativas del día 4 y el día 7 después del replatado muestran la expansión de los organoides, confirmando la capacidad de identificar visualmente organoides viables (las imágenes se toman a un aumento objetivo de 5x). Las imágenes representativas de organoides considerados vivos o muertos se ven en (B). Las imágenes se toman con un aumento objetivo de 5x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Imágenes representativas de hibridación de ARN in situ de esferoides hepáticos. Se tomaron imágenes representativas de los marcadores LGR5, KRT7, FOXA1 y CYP3A12 a un aumento objetivo de 60x de las muestras del día 2-7 después del paso. Las moléculas positivas de ARNm se tiñen de rojo. AQP1 no se expresó en las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Composición incompleta de la solución quelante (CSI) Concentración final 500 ml H2O NA 2,49 g Na2HPO4-2H2O 4,98 mg/ml 2,7 g KH2PO4 5,4 mg/ml 14 g de NaCl 28 mg/ml 0,3 g KCl 0,6 mg/ml 37,5 g sacarosa 75 mg/ml 25 g de D-sorbitol 50 mg/ml Composición completa de la solución quelante (CCS) V/V % o concentración final Solución de quelación incompleta 20% H2O estéril 80% TDT 520 μM Pluma Strep Pluma: 196 U/mL; Estreptococo 196 ug/mL Composición de medios organoides Concentración final DMEM/F12 avanzado NA FBS (en inglés) 8% Glutamax 2 mM HEPES 10 mM Primocina 100 μg/ml Suplemento B27 1x Suplemento N2 1x N-acetil-L-cisteína 1 mM EGF murino 50 ng/ml Noggin murino 100 ng/ml R-Spondin-1 humano 500 ng/ml Murine Wnt-3a 100 ng/ml [Leu15]-Gastrina I humana 10 nM Nicotinamida 10 mM A-83-01 500 nM SB202190 (inhibidor de P38) 10 μM TMS (trimetoprima sulfametoxazol) 10 μg/ml Componentes adicionales Concentración final Inhibidor de ROCK (Y-27632) 10 μM Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) 2,5 μM Composición de medios de congelación Porcentaje V/V Medios organoides e inhibidor de ROCK 50% FBS (en inglés) 40% Dimetilsulfóxido (DMSO) 10% Composición faa Porcentaje V/V Etanol (100%) 50% Ácido acético, glacial 5% Formaldehído (37%) 10% Agua destilada 35% Tabla 1: Composición de soluciones y medios. Una lista de componentes y concentraciones de soluciones quelantes incompletas y completas, CMGF+ (medios organoides), medios de congelación y FAA. Tabla complementaria 1: Plantilla de cuidado organoideo. Esta plantilla permite tomar notas organoides precisas y reproducibles para cada día. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla complementaria 2: Sondas de hibridación de ARN in situ. Lista de sondas diseñadas específicamente para objetivos de ARNm canino por un fabricante de la tecnología para realizar la técnica de hibridación in situ de ARN. Se enumera información sobre la importancia de los marcadores individuales, el nombre de una sonda, su número de referencia y la región de destino. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Actualmente hay una falta de protocolos estandarizados disponibles para el aislamiento y mantenimiento de organoides hepáticos e intestinales caninos. Se justifica el establecimiento de procedimientos operativos estándar para cultivos de organoides para que este modelo sea aplicable en diferentes entornos de laboratorio. Específicamente, proporcionar protocolos operativos estandarizados para el cultivo de estos modelos organoides caninos es clave para caracterizar el crecimiento normal de los organoides durante el cultivo y el pasaje para derivar puntos de tiempo óptimos para la expansión y el mantenimiento. Los organoides intestinales caninos cultivados mediante el protocolo han sido previamente caracterizados por Chandra et ^al.12.

Uno de los pasos más críticos del protocolo es la transmisión de organoides. Se determinó que el momento óptimo para el primer paso de los esferoides hepáticos era el día 7 después del aislamiento en función de las mediciones de esferoides hepáticos. El volumen máximo de esferoides se alcanzó en el día 7, y al mismo tiempo, los esferoides comenzaron a brotar y formaron organoides hepáticos. El aumento en el volumen total de organoides desde el día 2-7 después del aislamiento fue de más de 365 veces, lo que sugiere que el tiempo de paso óptimo es más largo que el cultivo de organoides intestinales caninos. Después de 7 días en cultivo, no se observaron signos gruesos de apoptosis celular en el esferoide hepático, incluso sin limpieza ni paso (Figura 7). Pasar los organoides intestinales y hepáticos puede ser un desafío, ya que el procedimiento puede conducir a la pérdida de células y la viabilidad alterada. Los resultados indican que la incubación prolongada de organoides hepáticos con proteasa similar a la tripsina (hasta 12 min) no influye negativamente en el subcultivo. La incubación de los organoides en proteasa similar a la tripsina durante más de 24 minutos puede ser perjudicial para el subcultivo posterior de los organoides.

En caso de rotura subóptima en los grupos celulares con el paso organoide, la disociación mecánica en lugar de la incubación prolongada con proteasa similar a la tripsina podría ser más beneficiosa. Si se encuentran problemas con la disociación adecuada de los organoides, se puede intentar un breve vórtice de las muestras para mejorar el rendimiento del pasaje. Por otro lado, el vórtice tiene el potencial de arruinar un cultivo y dañar las células, por lo que solo debe usarse cuando otros procedimientos han fallado repetidamente. La ruptura de organoides hepáticos en células individuales reduce la tasa de crecimiento de los organoides, mientras que dividirlos en grupos de células puede mejorar en gran medida su viabilidad. Se eligieron diez minutos como tiempo de incubación para el protocolo de organoides. Se consideró que un punto de tiempo de incubación de 12 minutos no era citotóxico en comparación con una incubación de 24 minutos en el experimento de proteasa similar a la tripsina.

El experimento de supervivencia confirmó que los organoides hepáticos caninos podrían sobrevivir hasta 19,5 días en condiciones desfavorables (agotamiento estructural y nutricional). Los organoides que sobrevivieron a estas condiciones por más tiempo se cultivaron con medios CMGF +. Esta observación podría haber sido causada por el crecimiento más lento de organoides hepáticos en medios no suplementados con inhibidor de Rock y GSK3β. Los cultivos de organoides con CMGF+ R/G crecieron más rápido y pueden haber agotado sus recursos más rápido. Este experimento abre posibilidades de miniaturizar el cultivo de organoides caninos para lograr una conversión del sistema de alto rendimiento. Tal tecnología muestra el potencial de facilitar el descubrimiento de fármacos o estudios toxicológicos a un costo sustancialmente reducido.

Algunos problemas comunes que se encuentran durante el mantenimiento del cultivo de organoides caninos son la solidificación inadecuada de la muestra durante el revestimiento, la contaminación del cultivo y el establecimiento de la densidad y el tamaño adecuados de los organoides. Si el ECM solubilizado se solidifica prematuramente durante el recubrimiento, colóquelo inmediatamente en hielo durante 10 min. Si la ECM solubilizada no forma estructuras en forma de cúpula, es probable que no se hayan eliminado suficientes medios de la muestra. Si este es el caso, diluya la muestra con un ECM más solubilizado hasta que se formen cúpulas.

Cuando se encuentra contaminación fúngica o bacteriana en una placa entera (ver Figura 4), la mejor solución es desechar la placa. Se puede intentar el tratamiento con medicamentos antimicóticos o antibióticos, pero el éxito de tal intento es extremadamente bajo. Si un solo pozo está contaminado en una placa, los pozos viables y no afectados pueden limpiarse (siga los pasos 4.1 a 4.5) en una placa nueva y monitorearse de cerca. Si la muestra ya ha sido congelada de emergencia, es aconsejable desechar toda la muestra, ya que la descongelación de la muestra expone a la incubadora a un riesgo de contaminación adicional.

El cultivo de organoides sanos debe estar al menos en la categoría de tamaño mediano y densidad media o mayor. La densidad óptima es crucial para el crecimiento del cultivo de organoides. La densidad más baja debe corregirse limpiando los organoides a densidad media. Si se produce la situación de densidad extrema (hacinamiento), los organoides deben ampliarse a más pozos. Los signos gruesos de apoptosis celular a menudo acompañan tanto al hacinamiento como a la baja densidad del cultivo de organoides. Si estos problemas no se corrigen a tiempo, todo el cultivo de organoides se volverá apoptótico en cuestión de días. Si los organoides alcanzan un tamaño extra grande o una densidad muy alta, el cultivo debe usarse para un experimento, congelación o fijación.

El medio organoide actualmente contiene 17 componentes, y la adición de factores de crecimiento necesarios para el mantenimiento y la expansión de los organoides puede ser costosa. Este problema se puede resolver mediante el cultivo de cultivos celulares 2D que sintetizan los factores de crecimiento para producir CMGF+ condicionado. El cultivo celular L-WRN produce factores de crecimiento Wnt-3a, R-Spondin-3 y ^Noggin37. La colonia celular utiliza un 90% de DMEM/F12 y un 10% de medios de cultivo FBS. Cuando el cultivo alcanza el 90 por ciento de confluencia, los medios se cosechan todos los días durante 1 semana. El medio cosechado se mezcla con 2x CMGF + (sin estos factores de crecimiento). Si bien los cultivos 2D pueden producir los factores de crecimiento necesarios a una fracción del costo, se debe esperar el tiempo y la preparación adicionales para producir los medios. Las concentraciones de factores de crecimiento entre lotes de medios condicionados también pueden ^diferir37,38.

Los cultivos de organoides derivados de células madre adultas caninas son un modelo biomédico único que puede ayudar a alcanzar los objetivos de la Iniciativa Una ^Salud39. La tecnología organoide se puede utilizar en muchas áreas de investigación básica y biomédica, que abarcan desde la biología del desarrollo, la fisiopatología, el descubrimiento y las pruebas de fármacos, la toxicología hasta el estudio de las enfermedades infecciosas y la medicina ^{regenerativa40}. La investigación traslacional y la traslacional inversa son áreas en las que los organoides caninos son ^aplicables15. Los perros se han utilizado durante siglos en entornos experimentales traslacionales, y su condición de animales de compañía también ha facilitado su posición como una de las especies más exploradas en medicina veterinaria.

En conclusión, este manuscrito proporciona protocolos operativos estandarizados para el aislamiento, mantenimiento, recolección y biobanco de organoides hepáticos e intestinales caninos para facilitar la aplicación de este modelo en diversos campos biomédicos. Este modelo es especialmente adecuado para promover la investigación traslacional inversa como herramienta de la Iniciativa Una Salud para promover el intercambio inter e intradisciplinar de conocimientos.

Materials

Chelating solution
D-Sorbitol	Fisher Chemical	BP439-500
DTT	Promega	V3151
KCl	Fisher Chemical	P217-500
KH2PO4	Sigma	P5655-100G
Na2HPO4-2H2O	Sigma	S5136-100G
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
Pen Strep	Gibco	15140-122
Sucrose	Fisher Chemical	S5-500
Organoid media
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
Trimethoprim	Sigma	T7883-5G
Sulfamethoxazole	Sigma-Aldrich	S7507-10G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Chemicals	D128-500
EDTA, pH 8.0, 0.5 M	Invitrogen	15575-038
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
RNAlater Soln.	Invitrogen	AM7021	RNA Storage Reagent
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Other
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
ACD Hybez II Hybridization System	ACD a biotechne brand	321710
Centrifuge Tube, 15 mL	Corning	430766
CoolCell LX	Corning	BCS-405MC
Cryogenic Vials	Corning	430488
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	Fisherbrand	05-539-13
GyroMini Nutating mixer (Rocker)	Labnet	S0500-230V-EU
Heat Bath	Lab-Line Instruments	3000
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	SpectrophotometerAnalysis
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Laboratory Flexible Film Tape
Protected Disposable Scalpels	Bard-Parker	239844
RNAscope 2.5 HD Assay – RED	ACD a biotechne brand	322350
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents	ACD a biotechne brand	322330
RNAscope Target Retrieval Reagents	ACD a biotechne brand	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	ACD a biotechne brand	310091
Tissue Culture Dish	Dot Scientific	6676621
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929