连续流PCR微流控芯片中 大肠杆 菌的扩增及毛细管电泳系统的检测
Summary
该协议描述了如何构建基于微流控芯片的连续流聚合酶链系统以及如何在实验室中构建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简单方法。
Abstract
聚合酶链反应（PCR）是一种用于扩增靶基因的传统方法，在生物分子诊断中发挥着重要作用。然而，传统的PCR由于温度变化效率低，非常耗时。该工作提出了一种基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。通过将PCR溶液运行到放置在不同温度的加热器上的微通道中，可以大大缩短扩增时间。此外，由于毛细管电泳（CE）是区分阳性和假阳性PCR产物的理想方法，因此构建了CE系统以实现DNA片段的高效分离。本文介绍了通过内部构建的CF-PCR系统扩增大 肠杆菌 （大肠杆菌）的过程以及CE对PCR产物的检测。结果表明， 大肠杆菌 的靶基因在10 min内成功扩增，表明这两个系统可用于核酸的快速扩增和检测。
Introduction
聚合酶链反应（PCR）是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，从而扩增痕量的DNA，数亿次。已广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、法医鉴定等领域。PCR过程主要包括三个步骤：90-95°C变性，50-60°C退火，72-77°C延伸。 热循环是PCR过程的重要组成部分;然而，传统的PCR热循环仪不仅体积庞大，而且效率低下，大约需要40分钟才能完成25个循环。为了克服这些局限性，在内部建立了一个基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。CF-PCR通过将PCR溶液驱动到放置在不同温度下的加热器上的微通道中，可以大大节省时间1,2,3,4,5。
由于毛细管电泳（CE）具有高分辨率、高速和优异的重现性6,7,8,9,10,11等诸多优点，因此已成为实验室中用于分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格高昂，大多数实验室，尤其是发展中国家的实验室，负担不起这项技术。在此，我们概述了如何制造CF-PCR微流控芯片以及如何在实验室中构建多功能CE系统的协议。我们还演示了该CF-PCR系统扩增大肠杆菌的过程以及CE系统对PCR产物的检测。通过遵循本协议中描述的程序，用户应该能够制造微流控芯片，制备PCR溶液，构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立简单的CE系统，即使资源有限，也可以分离DNA片段。
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR 和 CE 都是核酸分析中两种流行的生物技术。本文介绍了使用CF-PCR和CE系统进行 大肠杆 菌扩增和PCR产物检测，两者均由内部构建。由于大肠杆菌的传热速率高，在10 min内成功扩增了 大肠杆 菌的靶基因。小于 1,500 bp 的 DNA 片段在 8 分钟内分离（图 5）。这两种技术的最大优点是，与传统的PCR和平板凝胶电泳方法相比，它可以大大节省时间。研究人员应该记住，…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国上海市科学技术委员会的支持（No.19ZR1477500和No.18441900400）。我们衷心感谢上海理工大学（No.2017KJFZ049）的资助。
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
