Amplifiering av Escherichia coli i ett mikrofluidiskt PCR-chip med kontinuerligt flöde och dess detektion med ett kapillärelektroforessystem
Summary
Detta protokoll beskriver hur man bygger ett polymeraskedjesystem baserat på ett mikrofluidikchip och hur man bygger ett kapillärelektroforessystem i labbet. Den presenterar en enkel metod för analys av nukleinsyror i labbet.
Abstract
Polymeraskedjereaktion (PCR) är en traditionell metod som används för amplifiering av en målgen som har spelat en viktig roll inom biomolekylär diagnostik. Traditionell PCR är dock mycket tidskrävande på grund av den låga temperaturvariationseffektiviteten. Detta arbete föreslår ett CF-PCR-system (Continuous-Flow-PCR) baserat på ett mikrofluidiskt chip. Förstärkningstiden kan minskas avsevärt genom att köra PCR-lösningen i en mikrokanal placerad på värmare inställda på olika temperaturer. Dessutom, eftersom kapillärelektrofores (CE) är ett idealiskt sätt att skilja positiva och falskt positiva PCR-produkter, byggdes ett CE-system för att uppnå effektiv separation av DNA-fragmenten. Detta dokument beskriver processen för amplifiering av Escherichia coli (E. coli) med CF-PCR-systemet som byggts internt och detektionen av PCR-produkterna med CE. Resultaten visar att målgenen för E. coli framgångsrikt amplifierades inom 10 minuter, vilket indikerar att dessa två system kan användas för snabb amplifiering och detektion av nukleinsyror.
Introduction
Polymeraskedjereaktion (PCR) är en molekylärbiologisk teknik som används för att amplifiera specifika DNA-fragment och därigenom förstärka spårmängder av DNA hundratals miljoner gånger. Det har använts i stor utsträckning inom klinisk diagnos, medicinsk forskning, livsmedelssäkerhet, rättsmedicinsk identifiering och andra områden. PCR-processen består huvudsakligen av tre steg: denaturering vid 90–95 °C, glödgning vid 50–60 °C och utvidgning vid 72–77 °C. Termisk cykling är en viktig del av PCR-processen; Den traditionella PCR-termiska cyklerna är dock inte bara skrymmande utan också ineffektiv och kräver cirka 40 minuter för att genomföra 25 cykler. För att övervinna dessa begränsningar byggdes ett PCR-system med kontinuerligt flöde (CF-PCR) internt, baserat på ett mikrofluidiskt chip. CF-PCR kan spara mycket tid genom att driva PCR-lösningen in i mikrokanaler placerade på värmare vid olika temperaturer 1,2,3,4,5.
Eftersom kapillärelektrofores (CE) har många fördelar, såsom hög upplösning, hög hastighet och utmärkt reproducerbarhet 6,7,8,9,10,11, har det blivit ett populärt verktyg i labbet för analys av nukleinsyror och proteiner. De flesta laboratorier, särskilt laboratorier i utvecklingsländerna, har dock inte råd med denna teknik på grund av det höga priset på CE-instrumentet. Här har vi beskrivit protokoll för hur man tillverkar CF-PCR-mikrofluidikchipet och hur man bygger ett mångsidigt CE-system i labbet. Vi demonstrerar också processen för amplifiering av E. coli med detta CF-PCR-system och detektionen av PCR-produkterna med CE-systemet. Genom att följa de procedurer som beskrivs i detta protokoll bör användare kunna tillverka mikrofluidiska chips, förbereda PCR-lösningar, bygga ett CF-PCR-system för nukleinsyraamplifiering och inrätta ett enkelt CE-system, även med begränsade resurser, för att separera DNA-fragment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både PCR och CE är två populära biotekniker vid analys av nukleinsyror. Detta dokument beskriver amplifieringen av E. coli och detektionen av PCR-produkterna med hjälp av CF-PCR- och CE-systemen, båda byggda internt. Målgenen för E. coli amplifierades framgångsrikt inom 10 minuter på grund av de höga värmeöverföringshastigheterna. DNA-fragment som var mindre än 1 500 bp separerades inom 8 minuter (Figur 5). Den stora fördelen med dessa två tekniker är att …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr 19ZR1477500 och nr 18441900400). Vi är tacksamma för ekonomiskt stöd från University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
