הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.
תהודת פלסמון פני השטח (SPR) משמשת למדידת קשירת המגלוטינין (HA) לדמיר ציאנובירין-N (CV-N) שהוחלף בתחום ולניטור אינטראקציות בין פפטידים מנוזילטים לבין אתר הקשירה בעל הזיקה הגבוהה של CV-N. דווח כי קוצים במעטפת הנגיף gp120, ha וגליקופרוטאין אבולה (GP) 1,2 קושרים אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה ונמוכה ב-CVN2 דימרי. פפטיד HA דימנוזילי קשור גם בשני אתרי הקישור בעלי הזיקה הנמוכה למולקולה מהונדסת של CVN2, הנושאת אתר זיקה גבוהה עבור הליגנד המתאים ועוברת מוטציה כדי להחליף קשר דיסולפיד מייצב בכיס קשירת הפחמימות, ובכך לאשר קשירה רב-ערכית. קשירת HA מוצגת לאתר קשירה אחד בעל זיקה גבוהה של פסאודו-נוגדנים CVN2 בקבוע דיסוציאציה (KD) של 275 ננומטר המנטרל עוד יותר את נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) באמצעות אוליגומריזציה. קורלציה בין מספר הגשרים הדיסולפידים ב-CVN2 שהוחלפו בתחום, אשר מופחתים מ-4 ל-2 על-ידי החלפת ציסטינים בזוגות שאריות קוטביות של חומצה גלוטמית וארגינין, מביאה לירידה בזיקה ל-HA. בין האינטראקציות החזקות ביותר, אבולה GP1,2 קשורה על ידי CVN2 עם שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה בתחום הננומולרי התחתון באמצעות גליקן המעטפת ללא תחום טרנסממברנה. במחקר הנוכחי, קשירת CV-N מונומרי רב-ספציפי לתסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) גליקופרוטאין (S) נמדדת ב- K D = 18.6 μM בהשוואה לננומולאר KD לאותם קוצים אחרים בנגיף, ובאמצעות תחום קשירת הקולטן שלו בטווח הטוחנות האמצעיות μ.
פעילות אנטי-ויראלית הקשורה לטתרין מושרית על ידי אינטרפרון-α, והיא מורכבת מקשירה מבוססת חלבון, מה שמוביל לשמירה של וירוסים שנוצרו במלואם על משטחי תאים נגועים1. הצורך בגליקוזילציה של טטרין בעיכוב שחרור הנגיף עדיין אינו ודאי, מה שמרמז על החשיבות של דפוסי גליקוזילציה על גליקנים המבוטאים באופן רקומביננטי עבור מחקרים במבחנה 1,2, אשר תלוי בקונפורמציה של (במקרה של נגיף שפעת) השפעת המגלוטינין HA 3,4 . צוין כי שינוי של אוליגוסכריד הקשור לגליקוזילציה הקשורה ל-N מספיק להגבלה בתיווך תרין של שחרור HIV מסוג 12, בעוד שדמריזציה ממלאת תפקיד חיוני במניעת שחרור הנגיף, ובכך מערבת את תחום הטרנס-ממברנה או גליקוזיל-פוספטידיל-אינוזיטול (GPI)-עוגן לקשירת הוויריונים הניצנים5 . תכונות ייחודיות מתוארות עבור טתרין אנושי ומורין כדי לחסום וירוסים עטופים מרובים, רטרו-וירוסים, ופילו-וירוסים. BST-2/tetherin הוא חלבון אנטי-ויראלי הניתן לאינטרפרון של מערכת החיסון המולדת1,6, הפועל עם פעילות אנטי-ויראלית רחבת טווח ונוגד אנטגוניזם על ידי גליקופרוטאינים מעטפת5 כדי לבצע טרנסלוקציה של טטרין או לשבש את המבנה של ת’רין 6. לדוגמה, גליקופרוטאין HA של מעטפת המבוטא על פני השטח ונוירמינידאז על נגיף שפעת A ידועים באנטגוניזם של טטרין באופן ספציפי לזן7, מה שמקל על זיהוי אתרי קשירת קולטן מארח8. נוגדנים המכוונים לגליקן נחקרים בסטויכיומטריה של יחסי הגומלין שלהם עם מגני הגליקן המותאמים אישית במהירות ב-HA, וכתוצאה מכך נוצרת זיקה לתת-סוגים שפעת A H3N2 ו-H1N14.
כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה בין חומרים אנטי-ויראליים לבין קוצים במעטפת הנגיף, כלומר ליגנדות פחמימות, ושיטות אימונולוגיות וספקטרוסקופיות משלימות, מסונתזים כימית מונו, די-די-מנוז ותלת-מנוז. הפפטידים המנוזילים נוצרים באמצעות אזידו גליקוזילציה של גליקוזיל {בטא}-פראצטטים לטרנספורמציה של 1,2-טרנס גליקוזיל אזידים9, המחקה את ה-N-אצטיל גלוקוזאמין ואוליגוסכרידים עתירי מנוז על פני השטח של וירוסים מסכני חיים. ביואיזוסטרים של טריאזול משמשים לחיקויים של קישורים היוצרים את השאריות המנוזיליות של פפטיד HA10 ומאפשרים אינטראקציות ספציפיות לאתר עם נגזרות CV-N אנטי-ויראליות סביב נקודת הגליקוזילציה השנייה הקשורה ל-N בתחום ראש ה-HA (HA למעלה עם 4 גליקנים מקושרים N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . אינטראקציות בין חומצה גלוטמית (Glu) וארגינין (Arg) לבין דיפול הסליל שנוצר ביטאו יציבות טובה של פפטידי המודל ושל חלבונים, אך הן מוצגות באמצעות SPR. אם משווים אותו לזיהוי אתר גליקוזילציה מסונתז כימית יחיד ב-HA10 על ידי עיכוב ישיר של קשירת קולטן על הגליקן, הוכחה זיקה גבוהה יותר של מבנה Fc בעל מוטציה של ארבעה אתרים לקולטן שלו כמעוררת פונקציות אפקטים in vivo, וחושפת את ההרכב הלא קשור של גליקנים מקושרים N המחוברים למוטציה של Fc כדי לקבוע באופן מכניסטי13.
CV-N מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד HIV 14,15, שפעת16 ונגיף האבולה, המתווך על ידי קשירת ננומולר לשינויים אוליגוסכרידיים עתירי מנוז על חלבוני ספייק מעטפת12,17,18,19. קשירת שפעת HA לאתר קשירת פחמימות אחד בעל זיקה גבוהה (H) ב-CV-N או בשני Hs ב-CVN2 דימרי מקושר קוולנטית נקבעת כבעלת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (K D) = 5.7 ננומטר (איור 1A) ו-KD = 2.7 ננומטר, בהתאמה. גם CV-N וגם CVN2 מכילים עוד אתר אחד או שניים של קשירת פחמימות בעלות זיקה נמוכה (L)s 12,17,20,21. אבולה GP1,2 נקשר ל-2H של CVN2 עם זיקות בתחום הננומולרי התחתון (KD = 26 ננומטר). CV-N WT מחייב לאבולה GP1,2 ו- HA מציג זיקות מ- K D = 34 nM ל- KD = 5.7 nM (A / New York / 55/04)12. לקטינים, כגון CV-N, המכוונים באופן ספציפי לגליקנים עתירי מנוז על מעטפות הנגיף, מעכבים עוד יותר את השכפול של נגיף הפטיטיס C, SARS-CoV, נגיף ההרפס, נגיף מרבורג ונגיף החצבת22.
מולקולת CV-N הקטנה נחקרה ביסודיות במשך יותר מ-20 שנה, שכן היא מתפקדת כדי לקשור מגוון רחב של נגיפים כדי לעכב את כניסת הנגיף16,18. ניתוחים מבניים ומבחני זיקה מקשרים מצביעים על קישור צולב של שני Ls בדימר CVN2 שהוחלף על ידי קשירה דו-ערכית בטווח המיקרומולרי כדי להגביר את ההתלהבות לגליקופרוטאינים של מעטפת נגיפית10,19. קשירה סלקטיבית של Manα1-2Manα על זרועות Man(8) D1D3 ו-Man(9) כוללת שני אתרי קשירה בעלי זיקות שונות הממוקמים על פרוטומרים של חלבונים מנוגדים20, ובכך מגיעים לזיקות קשירה ננומולריות (איור 1B). לפיכך, CVN2 נחשב לנוגדן פסאודו בנוגע ליישומו לקשירת אפיטופים על HIV gp120, בדומה לנוגדנים מנטרלי וירוסים17. כאן, המחבר מעוניין לחקור את הקשירה הפוטנציאלית של CVN2 לספייק SARS-CoV-2 באמצעות תחום קשירת הקולטן שלו (RBD). עקומות קשירה של אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי משותק (ACE)-2 עם SARS-CoV-2 RBD התוצאה KD = 4.7 nM עבור אינטראקציה מחייבת רלוונטית ביולוגית זו23.
לעומת זאת, מחלקות אימונוגלובולינים נבחרות מזהות תבניות חלבונים מבניות ספציפיות ועקביות, המקנים מצע להבשלת זיקה באזורי HA24 המעוגנים בממברנה. CV-N מראה פעילות חזקה מאוד כמעט בכל נגיפי שפעת A ו-B16, והוא חומר אנטי-ויראלי המנטרל באופן נרחב. הידע שלנו אינו שלם על מיקומם של אפיטופים ממוקדים על הגבעול של HA1 ו-HA2 שעשויים לערב מבנים אפיטופיים למיקוד גליקן על ידי נוגדנים מנטרלים מאוד ובהשוואה לקשירת לקטין25.
איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת SPR עבור CV-N לקפיצות מעטפת הנגיף. (A) בדיקת SPR לקשירת CV-N לליגנד: חלבון HA באורך מלא (90 kDa). ערכת נתונים קינטית (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) המציגה כריכה כפולה בזמן אמת לשפעת HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 גרסה V2 נקשרת לליגנד DM משותק בטווח ריכוז של 500 ננומטר עד 16 מיקרומטר. רצף: שאריות L מודגשות בצהוב. שאריות H מודגשות באפור. E58 ו-R73 הם תחליף לציסטאינים בחלבון ה-wildtype והופכים את V2 לקפל חלבון יציב עם שלושה במקום ארבעה קשרים דיסולפידיים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
בעוד שמגן הגליקן בחלק העליון של HA הדיסטלי של הממברנה גורם לקשירת זיקה גבוהה ל-CV-N 12, קשירת CVN2 ל-HA הסמוכה לגשר דיסולפיד של החלק העליון של HA נצפתה גם באתרי הזיקה הנמוכה שלו10,12. אינטראקציות קוטביות שונות ואתרי אינטראקציה מזוהים בקשירת פחמימות על ידי CV-N. אינטראקציות אלה מאומתות על ידי יצירת וריאנטים נוק-אאוט באתר הקשירה כדי לתאם זיקות קשירה לגליקוזילציה חזויה בסיליקו 12. לפיכך, הפרויקט שואף להשוות פפטידי HA שעברו מנוזילציה כימית שנבדקו בעבר בזיקה ובספציפיות מחייבת עם רצפי פפטידים קצרים מקוצים הקשורים לסארס 2019-nCoV ו- SARS-CoV-2, המתרחשים באופן טבעי על ידי מספר קטן של אתרי גליקוזילציה שונים המקושרים ל- N וגליקוזילציה מקושרת O. באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים ומבחני קשירה, פינטו ועמיתיו מדווחים על נוגדן חד-שבטי, S309, שעשוי לזהות אפיטופ על חלבון ספייק SARS-CoV-2 המכיל גליקן שמור בתוך תת-הסוג Sarbecovirus, מבלי להתחרות בחיבור הקולטן26. הפרוטוקול של מחקר זה מתאר כיצד תכנון, הבעה ואפיון של וריאנטים של CV-N חשובים כדי לחקור כיצד CV-N ו-CVN2 נקשרים לחלבונים מסוכררים ולפפטידים מאנוסילטים סינתטיים באמצעות טכנולוגיית SPR10,12.
דימר CVN2L027 וגרסאות של אתר קשירה (V2-V5) מבוטאים באופן רקומביננטי וריאנטים הם עם תחליפי קשרים דיסולפידיים (C58E ו-C73R) (איור 2A). כמו כן, מוטציה עם מוטציה חד-נקודתית E41A מוכנה מכיוון שתנוחה זו נתפסה כשאריות של מגע צולב בין-מולקולרי. מוטציה זו היא מולקולה מעניינת נוספת למדידות קשירת SPR בין הלקטין לאוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה המפענחת תחומי קשירה ומאפשרת השוואה לצורה הדימרית. המבנה הגבישי המוחלף בתחום של CVN2 מראה מקשר גמיש, המשתרע בין 49 ל-54 שאריות. שני התחומים יכולים להמשיך לנוע סביב הציר כגופים קשיחים, ולפתח מונומר באמצעות אינטראקציות תחום תוך-מולקולריות (תחום A -שאריות 1-39;90-101- עם תחום B -שאריות 40-89) או דימר על ידי החלפת תחום בין-מולקולרי [תחום A (של המונומר הראשון) עם תחום B (של השני), ותחום B (של המונומר הראשון) עם תחום A (של העותק השני)]. אין אינטראקציות קרובות בין תחומי A ו-B של שני הפרוטומרים, למעט Glu4128. ניתן לפתח את הגן עבור CV-N בשיטת PCR חוזרת עם אוליגוס מסונתז 40-mer29 ולאחר מכן הוא משויך לאתרים NdeI ו- BamHI של pET11a לטרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים כפי שתואר על ידי Keeffe, J.R.27. החלבון, המשמש להשגת המבנה הגבישי המתאים (PDB ID 3S3Y), כולל תג טיהור N-terminal 6-histidine ואחריו אתר ביקוע פרוטאז פקטור Xa. מוטגנזה מכוונת אתר משמשת ליצירת מוטציות נקודתיות, להחלפת קודונים ולהוספה או מחיקה של בסיסים או קודונים בודדים או מרובים להחלפת חומצות אמינו. טרנספורמציות אלה מספקות תובנה שלא תסולא בפז לגבי תפקוד ומבנה החלבון. CV-N, CVN2 ו-CVN3 עם ביטוי רקומביננטי וטיהור רקומביננטי נחקרו היטב מבחינה ביופיזית20,21,27, הם זולים לייצור, ולכן משמשים לאפיון מבחני קשירה לגליקנים המשותקים על שבבי חיישן SPR. בדיקה חיסונית קונבנציונלית הקשורה לאנזים (ELISA) מספקת פחות יכולת שכפול בנוגע לטכניקת האימוביליזציה של ליגנדות גליקן והופכת קשירה בזמן אמת של גרסאות שונות של אתרי קשירה, המוצגת עבור SPR, למבחני נקודות קצה.
וריאנט זיקה מחייבת CVN2L0-V2 (קפל שלם של CV-N הומודימרי עם החלפת גשר דיסולפידית10) מבוטא בתג שלו ב-Escherichia coli (E. coli), מטוהר מעל עמודת Ni-NTA תוך שימוש בכרומטוגרפיית זיקה ונבדק לקשירת HA (H3N2), פפטיד HA-פפטיד מונומנוזילי ופפטיד דימנוזילי באמצעות SPR. פפטידים מנוזיליים כימית, או חלבון HA ו-S, כולם ליגנדים ואמינים המוצמד למשטח השבב ההידרופילי באמצעות אסטרים תגובתיים או הנדסת חלבונים ביוטין-סטרפטאווידין. אותו הליך של ריצות עוקבות מוחל על ליגנדות אלה, המזריקות דילולים שונים של CV-N וריאנטים של CV-N (ו- CVN2) כדי לקבל מידע קינטי עבור ניתוחי האינטראקציה המולקולרית כמתואר להלן30. שבב חיישן SPR משותק RBD משמש לקשירת מחקרים על פפטידי CV-N ל-S, והזיקות מושוות לקשירת SARS-CoV-2 עם ACE2 האנושי.
זיקת הקשירה של CV-N מתואמת עם מספר אתרי הקישור הפונקציונליים [2H על דומיינים B, ו-2L על דומיינים A כאשר הם מהונדסים כדימר מוחלף דומיין]. גרסה עם זיקה מחייבת משתנה (CVN2L0-V2, קפל יציב הומודימרי של CV-N הכולל נוק-אאוט של גשר דיסולפיד) מתבטאת ב- E. coli, מטוהרת, ונבדקת חיובית לקשירת חלבון HA (H3N2) באמצעות SPR<su…
The authors have nothing to disclose.
המחבר מודה לד”ר כריסטיאן דרנטל מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגיה ב- TU Wien והמחלקה לרפואה III, המחלקה לנפרולוגיה ודיאליזה באוניברסיטה הרפואית של וינה, במיוחד ד”ר מרקוס ורמן על תמיכה טכנית ומדעית. ביטוי חלבונים בתאי יונקים נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה למשאבי טבע ומדעי החיים (BOKU) וינה. המחברת רוצה להביע את התודה העמוקה שלה לד”ר ניקו דנקבר מ- XanTec bioanalytics בדיסלדורף, גרמניה, על דיונים מדעיים מועילים על ביצוע מבחני הכריכה של SPR.
Äkta primeplus | Cytiva | ||
Amicon tubes | Merck | C7715 | |
Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
DTT | Merck | DTT-RO | |
EDC | Merck | 39391 | |
EDTA | Merck | E9884 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
Glycine HCl | Merck | 55097 | |
HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
HEPES | Merck | H3375 | |
His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
Imidazole | Merck | I2399 | |
IPTG | Merck | I6758 | |
Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
LB agar | Merck | 52062 | |
LB agar | Merck | 19344 | |
LB Lennox | Merck | L3022 | |
Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
NaH2P04 | Merck | S0751 | |
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
NaOH | Merck | S5881 | |
NHS | Merck | 130672 | |
NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
PBS | Merck | 806552 | |
PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
Peptone | Merck | 70171 | |
pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
SDS | Merck | 11667289001 | |
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
Sodim chloride | Merck | S9888 | |
Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
Triton-X100 | Merck | T8787 | |
Tryptone | Merck | 93657 | |
Tween20 | Merck | P1379 | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
X-gal | Merck | XGAL-RO | |
XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
Yeast extract | Merck | Y1625 |