표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링
Summary
본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.
Abstract
표면 플라즈몬 공명(SPR)은 도메인 스왑된 시아노비린-N(CV-N) 이량체에 대한 헤마글루티닌(HA) 결합을 측정하고 만노실화된 펩타이드와 CV-N의 고친화성 결합 부위 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 사용됩니다. 바이러스 외피 스파이크 gp120, HA 및 에볼라 당 단백질 (GP) 1,2는 이량 체 CVN2의 고 및 저 친화성 결합 부위 모두에 결합하는 것으로보고되었습니다. 디만노실화된 HA 펩타이드는 또한 CVN2의 조작된 분자에 대한 2개의 저친화성 결합 부위에 결합되며, 이는 각 리간드에 대해 고친화성 부위를 보유하고, 탄수화물 결합 포켓에서 안정화 이황화 결합을 대체하도록 돌연변이되어 다가 결합을 확인합니다. HA 결합은 올리고머화를 통해 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1)을 추가로 중화시키는 275 nM의 해리 상수(KD)에서 유사 항체 CVN2의 하나의 고친화성 결합 부위에 나타난다. 시스틴을 글루탐산과 아르기닌의 극성 잔기 쌍으로 대체하여 4에서 2로 감소하는 도메인 스왑 CVN2의 이황화 다리 수를 상관 시키면 HA에 대한 결합 친화도가 감소합니다. 가장 강력한 상호 작용 중 에볼라 GP1,2는 막 횡단 도메인이없는 외피 글리 칸을 사용하여 낮은 나노 몰 범위의 두 개의 고 친화성 결합 부위와 CVN2에 의해 결합됩니다. 본 연구에서, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 당단백질에 대한 다특이적 단량체 CV-N의 결합은KD = 18.6μM에서 다른 바이러스 스파이크에 대한 나노몰 KD와 비교하여 측정되며, 중간 μ몰 범위의 수용체 결합 도메인을 통해 측정됩니다.
Introduction
테더린 관련 항바이러스 활성은 인터페론-α에 의해 유도되고, 단백질 기반 테더를 포함하며, 이는 감염된세포 표면 1에 완전히 형성된 비리온의 보유를 유도한다. 바이러스 방출 억제에서 테테린 글리코실화의 필요성은 여전히 불확실하며, 이는 (인플루엔자 바이러스의 경우) 표면 발현 인플루엔자 헤마글루티닌 HA3,4의 형태에 의존하는 시험관 내 연구 1,2를 위한 재조합 발현 글리칸에 대한 글리코실화 패턴의 중요성을 암시합니다. . N-결합 글리코실화에 묶인 올리고당의 변형은 HIV 유형-1 방출2의 테더린 매개 제한에 충분하며, 이량체화는 바이러스 방출을 방지하는 데 필수적인 역할을 하며, 이에 따라 막횡단 도메인 또는 글리코실-포스파티딜-이노시톨(GPI)-앵커를 수반하여 신진 비리온을 테더링하는 것으로 나타났습니다.5 . 인간 및 쥐 테더린이 여러 외피 바이러스, 레트로바이러스 및 필로바이러스를 차단하는 고유한 특징이 설명됩니다. BST-2 / 테더 린은 광범위한 항 바이러스 활성으로 작용하는 선천성 면역 1,6의 인터페론 유도 항 바이러스 단백질이며 외피 당 단백질5에 의해 길항되어 테 테린을 전위하거나 테더린 6의 구조를 파괴합니다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 상의 표면-발현된 외피 당단백질 HA 및 뉴라미니다제는 균주-특이적 방식으로7 테더린 길항작용에 대해 잘알려져 있으며, 숙주 수용체 결합 부위8의 인식을 용이하게 한다. 글리칸 표적 항체는 HA에서 빠르게 맞춤화되는 글리칸 차폐와의 상호 작용의 화학량론에서 연구되어 인플루엔자 A H3N2 및 H1N1아형에 대한 결합 친화도를 초래합니다4.
항바이러스제와 바이러스 외피 스파이크, 즉 탄수화물 리간드, 및 상보적인 면역학적 및 분광학적 방법 사이의 결합 메카니즘을 밝히기 위해, 모노-, 디- 및 트라이-만노스 잔기가 화학적으로 합성된다. 만노실화된 펩티드는 생명을 위협하는 바이러스의 표면에서 전형적으로 발견되는 N-아세틸글루코사민 및 고만노스 올리고당을 모방하여 1,2-트랜스 글리코실 아지드9로 형질전환된 글리코실 {베타}-퍼아세테이트의 아지도글리코실화를 통해 생성됩니다. 트리아 졸 생물 동위 원소는 HA 펩티드10의 만노 실화 잔기를 형성하는 결합을 모방하고 HA 헤드 도메인 (4 개의 N- 결합 글리 칸 N54, N97, N181, N301)의 두 번째 N- 결합 글리코 실화 스팟 주위의 항 바이러스 CV-N 유도체와의 부위 특이 적 상호 작용을 촉진하는 데 사용됩니다 (4 개의 N- 연결된 글리 칸 N54, N97, N181, N301)8,11,12 . 글루탐산 (Glu)과 아르기닌 (Arg)과 결과 나선 쌍극자 사이의 상호 작용은 모델 펩타이드와 단백질 모두의 우수한 안정성을 나타내지 만 SPR을 사용하여 시각화됩니다. 글리칸 모이어티 상의 수용체 결합을 직접 억제함으로써HA10 상의 단일 화학적으로 합성된 글리코실화 부위를 인식하는 것과 비교하면, 그의 수용체에 대한 4-부위 돌연변이된 Fc 구조의 더 높은 친화도는 생체내에서 이펙터 기능을 유도하는 것으로 나타나서, Fc 돌연변이체에 부착된 N-연결된 글리칸의 무관한 조성이 기계적으로 결정됨을 나타낸다(13).
CV-N은 HIV 14,15, 인플루엔자16 및 에볼라 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 나타내며, 이는 외피 스파이크 단백질12,17,18,19의 고 만노스 올리고당 변형에 대한 나노 몰 결합에 의해 매개됩니다. CV-N 또는 공유 결합 이량체 CVN2에서 2개의 Hs에서 하나의 고친화성 탄수화물 결합 부위(H)에 결합하는 인플루엔자 HA는 각각 평형 해리 상수(KD) = 5.7nM(도 1A)및 KD = 2.7nM을 갖는 것으로 결정된다. CV-N 및 CVN2 모두는 또 다른 하나 또는 두 개의 저친화성 탄수화물-결합 부위 (L)s 12,17,20,21을 보유한다. 에볼라 GP1,2는 낮은 나노 몰 범위(KD = 26 nM)의 친화력으로 CVN2의 2H에 결합합니다. 에볼라 GP1,2 및 HA에 대한 CV-N WT 결합은KD = 34 nM내지 KD = 5.7 nM (A/New York/55/04)12에서 친화도를 나타낸다. 바이러스 외피의 높은 만노스 글리 칸을 특이 적으로 표적으로하는 CV-N과 같은 렉틴은 C 형 간염 바이러스, SARS-CoV, 헤르페스 바이러스, 마르부르크 바이러스 및 홍역 바이러스22의 복제를 추가로 억제합니다.
작은 CV-N 분자는 바이러스 유입을 억제하기 위해 광범위한 바이러스에 결합하는 기능을 하기 때문에 20년 이상 철저히 연구되었습니다16,18. 구조 분석 및 결합 친화도 분석은 바이러스 외피 당단백질10,19에 대한 결합력을 향상시키기 위해 마이크로몰 범위의 2가 결합에 의해 도메인-스왑된 CVN2 이량체에서 2개의 L의 가교결합을 나타냅니다. Man(8) D1D3 팔과 Man(9)에 대한 Manα1-2Manα의 선택적 결합은 반대쪽 단백질 프로토머(20)에 위치한 상이한 친화도의 두 결합 부위를 구성하여 나노몰 결합 친화도에 도달합니다(그림 1B). 따라서, CVN2는 바이러스-중화 항체17과 유사하게, HIV gp120 상의 에피토프에 결합하는 그의 적용에 관한 유사-항체로 간주된다. 여기에서 저자는 수용체 결합 도메인(RBD)을 통해 SARS-CoV-2 스파이크에 대한 CVN2의 잠재적 결합을 조사하는 데 관심이 있습니다. SARS-CoV-2 RBD와 고정화된 인간 안지오텐신 전환 효소(ACE)-2의 결합 곡선은 이러한 생물학적으로 관련된 결합 상호작용에대해 KD = 4.7nM을 초래합니다23.
대조적으로, 선택된 면역글로불린 부류는 특이적이고 일관된 구조 단백질 패턴을 인식하며, 이는 막-앵커링된 HA 영역(24)에서 친화성 성숙을 위한 기질을 부여한다. CV-N은 거의 모든 인플루엔자 A 및 B 바이러스16에서 매우 강력한 활성을 나타내며 광범위하게 중화하는 항 바이러스제입니다. 우리의 지식은 고도로 중화되는 항체에 의한 글리칸 표적화를 위한 에피토픽 구조를 포함할 수 있는 HA1 및 HA2의 줄기 상의 표적화된 에피토프의 위치와 렉틴 결합25와 비교하여 불완전합니다.
그림 1: 바이러스 엔벨로프 스파이크에 대한 CV-N에 대한 SPR 결합 분석의 개략적 표현. (A) 리간드에 대한 CV-N 결합에 대한 SPR 분석: HA 전장 단백질(90kDa). 인플루엔자 HA A/New-York/55/04 (H3N2)에 대한 실시간 이중 참조 결합을 보여주는 운동 데이터 세트 (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM). (b) 500 nM 내지 16 μM의 농도 범위 내에서 고정화된 리간드 DM에 결합하는 CVN2L0 변이체 V2. 서열: L 잔기는 노란색으로 강조 표시된다. H 잔류물은 회색으로 강조 표시됩니다. E58 및 R73은 야생형 단백질의 시스테인을 대체하며 V2를 4 개의 이황화 결합 대신 3 개의 이황화 결합으로 안정적인 단백질 폴드로 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
막-원위 HA 상부 상의 글리칸 차폐물이 CV-N(12)에 대한 고-친화성 결합을 유도하는 반면, HA 상부 부분의 이황화 브릿지에 인접한 HA에 대한 CVN2 결합은 그의 저친화성 부위(10,12)에서 추가로 관찰되었다. 다양한 극성 상호작용 및 상호작용 부위가 CV-N에 의한 탄수화물 결합에서 확인된다. 이러한 상호작용은 결합 친화도를 인실리코예측된 글리코실화12에 상관시키기 위해 결합 부위에 녹아웃 변이체를 생성함으로써 검증된다. 따라서 이 프로젝트는 이전에 테스트한 화학적으로 만노실화된 HA 펩타이드를 결합 친화도 및 특이성에서 SARS 관련 2019-nCoV 스파이크 및 SARS-CoV-2의 짧은 펩타이드 서열과 비교하는 것을 목표로 합니다. Pinto와 동료들은 초저온 전자 현미경 및 결합 분석을 사용하여 수용체 부착 309와 경쟁하지 않고 Sarbecovirus 아속 내에 보존된 글리칸을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 에피토프를 잠재적으로 인식하는 단클론 항체S26을 보고합니다. 이 연구의 프로토콜은 CV-N 및 CVN2가 SPR 기술10,12를 사용하여 글리코 실화 단백질 및 합성 만노실화 펩타이드에 결합하는 방법을 연구하는 데 CV-N 변이체를 설계, 발현 및 특성화하는 것이 얼마나 중요한지 설명합니다.
탠덤-연결된 이량체 CVN2L027 및 결합 부위 변이체 (V2-V5)는 재조합적으로 발현되고, 변이체는 이황화 결합 치환 (C58E 및 C73R)을 갖는다(도 2A). 또한, 단일 점 돌연변이 E41A를 갖는 돌연변이는 이 위치가 분자간 교차 접촉 잔기로 간주되었기 때문에 제조된다. 이 돌연변이는 결합 도메인을 해독하는 렉틴과 고만노스 올리고당 사이의 SPR 결합 측정을 위한 또 다른 흥미로운 분자이며 이량체 형태와 비교할 수 있습니다. CVN2의 도메인 스왑 결정 구조는 49 내지 54 잔기 사이에서 확장되는 유연한 링커를 나타낸다. 두 도메인은 경첩 주위를 강체로 계속 이동할 수 있으며, 분자 내 도메인 상호 작용을 통해 단량체를 개발할 수 있습니다 (도메인 A- 잔기 1-39; 90-101-와 도메인 B- 잔기 40-89) 또는 분자간 도메인 스왑에 의한 이량 체 [도메인 A (첫 번째 단량체의) 도메인 B (두 번째의) 및 도메인 B (첫 번째 단량체의) 도메인 A (두 번째 사본)]. Glu4128을 제외하고는 두 프로토 머의 A 및 B 도메인 사이에 밀접한 상호 작용이 없습니다. CV-N에 대한 유전자는 40-mer 합성 올리고 29를 갖는 반복적 인 PCR 방법을 사용하여 개발 될 수 있으며, 이어서 Keeffe, J.R.27에 의해 설명 된 바와 같이 전기 적격 세포로의 형질 전환 (전기 천공)을 위해 pET11a의 NdeI 및 BamHI 부위로 서브 클로닝된다. 각각의 결정 구조 (PDB ID 3S3Y)를 달성하기 위해 사용되는 단백질은 N- 말단 6- 히스티딘 정제 태그와 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 부위 지향 돌연변이 유발은 점 돌연변이를 만들고, 코돈을 전환하고, 아미노산 교환을 위해 단일 또는 다중 염기 또는 코돈을 삽입 또는 삭제하는 데 사용됩니다. 이러한 변형은 단백질 기능과 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 재조합 발현 및 정제된 CV-N, CVN2 및 CVN3은 생물물리학적으로 잘 연구되어20,21,27, 생산 비용이 저렴하므로 SPR 센서 칩에 고정화된 글리칸에 대한 결합 분석을 특성화하는 데 사용됩니다. 기존의 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)은 글리 칸 리간드의 고정화 기술과 관련하여 재현성이 떨어지고 SPR에 대해 표시된 다양한 결합 부위 변이체의 실시간 결합을 종말점 분석으로 변환합니다.
결합 친화성 변이체 CVN2L0-V2 (이황화 브릿지 치환10을 갖는 동종이량체 CV-N의 무손상 폴드)를 대장균 (E. coli)에서 His-태그로 발현하고, 친화성 크로마토그래피를 적용하여 Ni-NTA 컬럼 상에서 정제하고, SPR을 사용하여 HA (H3N2), 모노만노실화된 HA-펩티드 및 디만노실화된 HA-펩티드에 대한 결합에 대해 시험한다. 화학적으로 만노실화된 펩티드, 또는 HA 및 S 단백질은 모두 친수성 칩 표면에 결합된 리간드 및 아민이다. 반응성 에스테르 또는 비오틴-스트렙타비딘 단백질 공학을 통해. 순차적 실행의 동일한 절차가 이들 리간드에 적용되어, CV-N의 다양한 희석물 및 CV-N(및 CVN2)의 변이체를 주입하여 후술하는 바와 같이 분자 상호작용 분석을 위한 동역학 정보를 수득한다(30). RBD 고정 SPR 센서 칩은 CV-N과 S 펩타이드에 대한 결합 연구에 사용되며 친화도는 인간 ACE2와의 SARS-CoV-2 결합과 비교됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CV-N의 결합 친화도는 기능적 결합 부위의 수와 상관 관계가 있습니다 [도메인 스왑 된 이량 체로 엔지니어링 될 때 도메인 B에서 2H, 도메인 A에서 2L]. 변경된 결합 친화도를 갖는 변이체 (CVN2L0-V2, 이황화 브릿지 녹아웃을 포함하는 CV-N의 동종이량체 안정한 폴드)를 대장균에서 발현시키고, 정제하고, SPR10을 사용하여 HA- 단백질 (H3N2)에 대한 결합에 대해 양성으로 테스트하고,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 빈 공과대학 생명공학 및 미생물학과의 Christian Derntl 박사와 비엔나 의과대학 신장투석학과의 의학과 III, 특히 Markus Wahrmann 박사의 기술 및 과학적 지원을 인정합니다. 포유류 세포에서의 단백질 발현은 비엔나 천연 자원 및 생명 과학 대학 (BOKU)의 생명 공학과에 의해 지원되었다. 저자는 SPR 결합 분석 수행에 대한 유용한 과학적 토론에 대해 독일 뒤셀도르프에 있는 XanTec bioanalytics의 Nico Dankbar 박사에게 깊은 감사를 표하고자 합니다.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
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