Разработка противовирусных агентов с помощью поверхностного плазмонного резонанса
Summary
Настоящий протокол описывает новые инструменты для анализов связывания SPR для изучения связывания CV-N с ГК, гликопротеином S, родственными гликанами гибридного типа и олигосахаридами с высоким содержанием маннозы. SPR используется для определения KD для связывания димерного или мономерного CV-N с этими гликанами.
Abstract
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) используется для измерения связывания гемагглютинина (HA) с димером циановирина-N (CV-N) с заменой домена и для мониторинга взаимодействия между маннозилированными пептидами и сайтом связывания CV-N с высоким сродством. Сообщалось, что всплески оболочки вируса gp120, HA и гликопротеин Эболы (GP) 1,2 связывают как высоко-, так и низкоаффинные сайты связывания на димерном CVN2. Диманнозилированный пептид HA также связывается в двух низкоаффинных сайтах связывания с инженерной молекулой CVN2, которая несет высокоаффинный сайт для соответствующего лиганда и мутирует, чтобы заменить стабилизирующую дисульфидную связь в углеводсвязывающем кармане, тем самым подтверждая поливалентное связывание. Показано связывание ГК с одним высокоаффинным сайтом связывания псевдоантител CVN2 при константе диссоциации (KD) 275 нМ, что дополнительно нейтрализует вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) посредством олигомеризации. Корреляция числа дисульфидных мостиков в CVN2 с заменой домена, которые уменьшаются с 4 до 2 путем подстановки цистинов в полярные пары остатков глутаминовой кислоты и аргинина, приводит к снижению сродства связывания с ГК. Среди самых сильных взаимодействий Ebola GP1,2 связан CVN2 с двумя высокоаффинными сайтами связывания в нижнем наномолярном диапазоне с использованием гликана оболочки без трансмембранного домена. В настоящем исследовании связывание мультиспецифического мономерного CV-N с тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2) спайка (S) гликопротеина измеряется при KD = 18,6 мкМ по сравнению с наномолярным KD с этими другими вирусными всплесками и через его рецептор-связывающий домен в среднем μ-молярном диапазоне.
Introduction
Тетерин-ассоциированная противовирусная активность индуцируется интерферон-α, и она содержит тросы на белковой основе, что приводит к удержанию полностью сформированных вирионов на инфицированных клеточных поверхностях1. Необходимость гликозилирования тетерина в ингибировании высвобождения вируса остается неопределенной, что подразумевает важность паттернов гликозилирования на рекомбинантно выраженных гликанах для исследований in vitro 1,2, которая зависит от конформации (в случае вируса гриппа) поверхностно экспрессированного гемагглютинина гриппа HA 3,4 . Отмечено, что модификации олигосахарида, привязанного к N-сцепленному гликозилированию, достаточно для тетерин-опосредованного ограничения высвобождения ВИЧ типа 12, в то время как димеризация играет существенную роль в предотвращении высвобождения вируса, тем самым вовлекая трансмембранный домен или гликозил-фосфатидил-инозитол (GPI)-якорь для привязки почковых вирионов5 . Описаны уникальные особенности человеческого и мышиного тетерина, блокирующего множественные оболочки вирусов, ретровирусов и филовирусов. BST-2/tetherin представляет собой интерферон-индуцируемый противовирусный белок врожденного иммунитета 1,6, действующий с широкой противовирусной активностью и антагонизированный оболочкой гликопротеинов5 с целью либо транслоцировать тетерин, либо нарушить структуру тетерина6. Например, поверхностно-экспрессированный гликопротеин оболочки ГК и нейраминидаза на вирусе гриппа А хорошо известны антагонизмом тетерина специфическим для штамма способом7, облегчающим распознавание сайтов связывания рецепторов хозяина8. Антитела, нацеленные на гликаны, изучаются в стехиометрии их взаимодействия с быстро настраиваемыми гликкановыми щитами на ГК, что приводит к сродству связывания с подтипами гриппа A H3N2 и H1N14.
Для выяснения механизмов связывания между противовирусными агентами и шипами оболочки вируса, т.е. углеводными лигандами, и комплементарными иммунологическими и спектроскопическими методами химически синтезируют моно-, ди- и триманнозные фрагменты. Маннозилированные пептиды создаются путем азидо-гликозилирования гликозил {бета}-перацетатов до трансформации 1,2-транс-гликозилазидов9, имитируя обычно встречающиеся N-ацетилглюкозамин и олигосахариды с высоким содержанием маннозы на поверхности опасных для жизни вирусов. Биоизостеры триазола используются для имитации связей, которые образуют маннозилированный остаток пептида ГК10 и облегчают сайт-специфические взаимодействия с противовирусными производными CV-N вокруг второго N-связанного пятна гликозилирования на головном домене ГК (вершина ГК с 4 N-связанными гликанами N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Взаимодействия между глутаминовой кислотой (Glu) и аргинином (Arg) и полученным в результате диполем спирали проявили хорошую стабильность как модельных пептидов, так и белков, но визуализируются с использованием SPR. Если сравнивать с распознаванием одного химически синтезированного участка гликозилирования наГК-10 путем прямого ингибирования связывания рецепторов на фрагментах гликана, более высокое сродство четырехсайтовой мутированной структуры Fc к его рецептору, как показано, вызывает эффекторные функции in vivo, выявляя несвязанный состав N-связанных гликанов, прикрепленных к мутанту Fc, который механически детерминирован13.
CV-N проявляет противовирусную активность в отношении ВИЧ14,15, гриппа16 и вируса Эбола, которая опосредована наномолярным связыванием с высокоманнозными олигосахаридными модификациями на белках оболочки 12,17,18,19. Связывание ГК гриппа с одним высокоаффинным углеводсвязывающим сайтом (H) в CV-N или двумя Hs в ковалентно связанном димерном CVN2 определяется как имеющее равновесные константы диссоциации (KD) = 5,7 нМ (рисунок 1A) и KD = 2,7 нМ соответственно. И CV-N, и CVN2 содержат еще один или два низкоаффинных сайта связывания углеводов (L) 12,17,20,21. Эбола GP1,2 связывается с 2H CVN2 со сродством в нижнем наномолярном диапазоне (KD = 26 нМ). Связывание CV-N WT с Эболой GP1,2 и HA проявляет сродство от KD = 34 нМ к KD = 5,7 нМ (A/New York/55/04)12. Лектины, такие как CV-N, которые специально нацелены на гликаны с высоким содержанием маннозы на вирусных оболочках, дополнительно ингибируют репликацию вируса гепатита С, SARS-CoV, герпесвируса, вируса Марбурга и вируса кори22.
Небольшая молекула CV-N тщательно изучается более 20 лет, поскольку она функционализируется для связывания широкого спектра вирусов для ингибирования проникновения вируса 16,18. Структурный анализ и анализы сродства связывания указывают на сшивание двух Ls в димере CVN2 с заменой домена путем двухвалентного связывания в микромолярном диапазоне для повышения авидности к гликопротеинам вирусной оболочки10,19. Селективное связывание Manα1-2Manα на руках Man(8) D1D3 и Man(9) содержит два сайта связывания различного сродства, расположенных на противоположных белковых протомерах20, тем самым достигая сродства к наномолярному связыванию (фиг.1B). Таким образом, CVN2 считается псевдоантителом относительно его применения для связывания эпитопов на ВИЧ gp120, аналогично вируснейтрализующим антителам17. При этом автор заинтересован в исследовании потенциального связывания CVN2 с всплеском SARS-CoV-2 через его рецептор-связывающий домен (RBD). Кривые связывания иммобилизованного человеческого ангиотензинпревращающего фермента (АПФ)-2 с RBD SARS-CoV-2 приводят к KD = 4,7 нМ для этого биологически значимого связывающего взаимодействия23.
Напротив, выбранные классы иммуноглобулинов распознают специфические и последовательные структурные белковые паттерны, которые придают субстрат для созревания аффинности в мембранно-анкерных областяхГК 24. CV-N проявляет высокую мощную активность почти у всех вирусов гриппа А и В16 и является широко нейтрализующим противовирусным средством. Наши знания являются неполными о расположении целевых эпитопов на стволе HA1 и HA2, которые, возможно, включают эпитопические структуры для нацеливания на гликаны с помощью высоконейтрализующих антител и по сравнению с связыванием лектина25.
Рисунок 1: Схематическое представление анализа связывания SPR для CV-N с всплесками оболочки вируса. (A) SPR Анализ для связывания CV-N с лигандом: полноразмерный белок HA (90 кДа). Набор кинетических данных (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 нМ), показывающий двойное связывание в реальном времени с гриппом HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 вариант V2 связывание с иммобилизованным лигандом DM в диапазоне концентраций от 500 нМ до 16 мкМ. Последовательность: L остатки выделены желтым цветом. Остатки H выделены серым цветом. E58 и R73 являются заменой цистеинов в белке дикого типа и делают V2 стабильной белковой складкой с тремя вместо четырех дисульфидных связей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В то время как гликановый щит на мембранно-дистальной верхней части ГК индуцирует высокоаффинное связывание с CV-N12, связывание CVN2 с ГК, прилегающее к дисульфидному мосту верхней части ГК, также наблюдалось на его участках с низким сродством 10,12. Различные полярные взаимодействия и сайты взаимодействия идентифицируются в углеводном связывании CV-N. Эти взаимодействия проверяются путем генерации нокаутирующих вариантов в месте связывания для корреляции сродства связывания с in silico предсказанным гликозилированием12. Таким образом, проект направлен на сравнение ранее протестированных химически маннозилированных пептидов ГК в сродстве связывания и специфичности с короткими пептидными последовательностями из связанных с SARS всплесков 2019-nCoV и SARS-CoV-2, встречающихся в природе, модифицированных небольшим количеством различных N-связанных сайтов гликозилирования и O-связанного гликозилирования. Используя криоэлектронную микроскопию и связывающие анализы, Пинто и его коллеги сообщают о моноклональном антителе S309, которое потенциально распознает эпитоп на спайковом белке SARS-CoV-2, содержащем сохраненный гликан в подроде sarbecovirus, не конкурируя с рецепторным присоединением26. Протокол этого исследования описывает, как проектирование, экспрессия и характеристика вариантов CV-N важны для изучения того, как CV-N и CVN2 связываются с гликозилированными белками и синтетическими маннозилированными пептидами с использованием технологии SPR10,12.
Тандем-связанный димер CVN2L027 и варианты сайта связывания (V2-V5) рекомбинантно экспрессированы, а варианты с заменами дисульфидных связей (C58E и C73R) (рисунок 2A). Кроме того, мутант с одноточечной мутацией E41A получают, потому что это положение рассматривалось как межмолекулярный перекрестно-контактирующий остаток. Этот мутант является еще одной интересной молекулой для измерений связывания SPR между лектином и высокоманнозными олигосахаридами, расшифровывающими связывающие домены, и позволяет сравнивать с димерной формой. Кристаллическая структура CVN2 с заменой домена показывает гибкий компоновщик, который простирается от 49 до 54 остатков. Два домена могут продолжать двигаться вокруг шарнира в виде твердых тел, развивая либо мономер через внутримолекулярные доменные взаимодействия (домен A -остатки 1-39;90-101- с доменом B -остатки 40-89), либо димер путем межмолекулярной замены домена [домен A (первого мономера) с доменом B (второго) и домен B (первого мономера) с доменом A (второй копии)]. Между доменами A и B двух протомеров нет тесных взаимодействий, за исключением Glu4128. Ген CV-N может быть разработан с использованием повторяющегося метода ПЦР с 40-мерным синтезированным олигосом29 и затем субклонирован в NdeI и BamHI участки pET11a для преобразования (электропорации) в электрокомпетентные клетки, как описано Keeffe, J.R.27. Белок, который используется для достижения соответствующей кристаллической структуры (PDB ID 3S3Y), включает N-концевую метку очистки 6-гистидина, за которой следует участок расщепления протеазы фактора Xa. Сайт-направленный мутагенез используется для создания точечных мутаций, переключения кодонов и вставки или удаления одного или нескольких оснований или кодонов для обмена аминокислотами. Эти превращения дают бесценное представление о функции и структуре белка. Рекомбинантно экспрессированные и очищенные CV-N, CVN2 и CVN3 были биофизически хорошо изучены 20,21,27, дешевы в производстве и, следовательно, используются для характеристики анализов связывания с гликанами, иммобилизованными на чипах датчиков SPR. Обычный иммуноферментный анализ (ИФА) обеспечивает меньшую воспроизводимость в отношении метода иммобилизации лигандов гликана и преобразует связывание в реальном времени различных вариантов сайта связывания, что показано для SPR, в анализы конечных точек.
Связывающе-аффинный вариант CVN2L0-V2 (неповрежденная складка гомодимерного CV-N с замещением дисульфидного моста10) экспрессируется His-меткой в Escherichia coli (E. coli), очищенной над колонкой Ni-NTA с применением аффинной хроматографии и проверенной на связывание с HA (H3N2), мономаннозилированным HA-пептидом и диманнозилированным HA-пептидом с использованием SPR. Химически маннозилированные пептиды, или белок HA и S, все они являются лигандами и амином, связанными с гидрофильной поверхностью чипа через реактивные сложные эфиры или биотин-стрептавидиновую белковую инженерию. Та же процедура последовательных запусков применяется к этим лигандам, вводя различные разведения CV-N и варианты CV-N (и CVN2) для получения кинетической информации для анализа молекулярного взаимодействия, как описано ниже30. RBD-иммобилизованный сенсорный чип SPR используется для исследований связывания пептидов CV-N в S, а сродство сравнивается с связыванием SARS-CoV-2 с ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ ACE2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сродство привязки CV-N коррелирует с количеством функциональных сайтов привязки [2H на доменах B и 2L на домене (доменах) A при проектировании как димер с заменой домена]. Вариант с измененным сродством связывания (CVN2L0-V2, гомодимерная стабильная складка CV-N, содержащая нокаут дисульфидного мо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит доктора Кристиана Дернтля из Департамента биотехнологии и микробиологии в Венском университете и Департамента медицины III, Отделения нефрологии и диализа в Медицинском университете Вены, особенно доктора Маркуса Варманна за техническую и научную поддержку. Экспрессия белка в клетках млекопитающих была поддержана кафедрой биотехнологии в Университете природных ресурсов и наук о жизни (BOKU) в Вене. Автор хочет выразить свое глубокое признание доктору Нико Данкбару из XanTec bioanalytics в Дюссельдорфе, Германия, за полезные научные дискуссии по выполнению анализов связывания SPR.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
- Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
- Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
- Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
- Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
- Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
- Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
- Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
- Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
- Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
- Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
- Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
- Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
- Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
- Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
- Bolmstedt, A. J., O’Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
- O’Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
- Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
- Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
- Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
- Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
- Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
- Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
- Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
- Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
- Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
- Fischer, M. J. E., Mol, N., Fischer, M. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 627, (2010).
- Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , 532-535 (2005).
- . QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to (2005)
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- . Expasy.org Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022)
- Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
- Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
- . Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28 Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022)
- Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. 5, 97-141 (2007).
- . Method Development Notes Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022)
- Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
- Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
- Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).
