Den nuværende protokol beskriver nye værktøjer til SPR-bindingsassays til undersøgelse af CV-N-binding til HA, S-glycoprotein, relaterede hybrid-type glycaner og oligosaccharider med høj mannose. SPR bruges til at bestemme KD til binding af enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glycaner.
Overfladeplasmonresonans (SPR) bruges til at måle hæmagglutinin (HA) binding til domænebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og til at overvåge interaktioner mellem mannosylerede peptider og CV-N’s bindingssted med høj affinitet. Virus kuvertspidser gp120, HA og Ebola glycoprotein (GP) 1,2 er blevet rapporteret at binde både bindingssteder med høj og lav affinitet på dimerisk CVN2. Dimannosyleret HA-peptid er også bundet på de to bindingssteder med lav affinitet til et konstrueret molekyle af CVN2, som bærer et sted med høj affinitet for den respektive ligand og muteret for at erstatte en stabiliserende disulfidbinding i kulhydratbindingslommen, hvilket bekræfter multivalent binding. HA-binding er vist til et bindingssted med høj affinitet af pseudo-antistof CVN2 ved en dissociationskonstant (KD) på 275 nM, der yderligere neutraliserer human immundefektvirus type 1 (HIV-1) gennem oligomerisering. Korrelation af antallet af disulfidbroer i domænebyttet CVN2, som reduceres fra 4 til 2 ved at erstatte cystiner i polære restpar af glutaminsyre og arginin, resulterer i reduceret bindingsaffinitet til HA. Blandt de stærkeste interaktioner er Ebola GP1,2 bundet af CVN2 med to bindingssteder med høj affinitet i det nedre nanomolære område ved hjælp af konvolutglycan uden et transmembrandomæne. I denne undersøgelse måles bindingen af det multispecifikke monomere CV-N til alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolær KD til de andre virusspidser og via dets receptorbindende domæne i det midterste μ-molære område.
Tetherin-associeret antiviral aktivitet induceres af interferon-α, og det omfatter proteinbaserede tethers, der fører til tilbageholdelse af fuldt dannede virioner på inficerede celleoverflader1. Nødvendigheden af tetheringlycosylering ved hæmning af virusfrigivelse er fortsat usikker, hvilket indebærer betydningen af glykosyleringsmønstre på rekombinant udtrykte glycaner til in vitro-undersøgelser 1,2, hvilket afhænger af konformationen af (i tilfælde af influenzavirus) overfladeudtrykt influenzahæmagglutinin HA 3,4 . Det er blevet bemærket, at modifikation af oligosaccharid bundet til N-bundet glykosylering er tilstrækkelig til tetherinmedieret begrænsning af HIV type-1-frigivelse2, mens dimerisering spiller en væsentlig rolle i forebyggelsen af virusfrigivelse og derved involverer transmembrandomænet eller glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) -anker til tøjring af de spirende virioner5 . Unikke funktioner er beskrevet for human og murine tetherin til at blokere flere indhyllede vira, retrovirus og filovirus. BST-2/tetherin er et interferoninducerbart antiviralt protein af den medfødte immunitet1,6, der virker med bredspektret antiviral aktivitet og modarbejdes af kuvertglycoproteiner5 for enten at translokere tetherin eller forstyrre strukturen af tetherin6. For eksempel er overfladeudtrykt kuvertglycoprotein HA og neuraminidase på influenza A-virus velkendte for tetherinantagonisme på en stammespecifik måde7, hvilket letter genkendelsen af værtsreceptorbindingssteder8. Glykanmålretningsantistoffer undersøges i støkiometrien af deres interaktioner med de hurtigt tilpassede glycanskærme på HA, hvilket resulterer i bindingsaffinitet til influenza A H3N2 og H1N1 undertype4.
For at belyse bindingsmekanismerne mellem antivirale midler og viruskuvertspidser, dvs. kulhydratligander og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-dele kemisk. De mannosylerede peptider dannes via azidoglycosylering af glycosyl {beta}-peracetater til 1,2-transglycosylazider transformation9, der efterligner de typisk fundne N-acetylglucosamin og høj-mannose oligosaccharider på overfladen af livstruende vira. Triazolbioisosterer anvendes til at efterligne bindinger, der danner den mannosylerede rest af HA-peptid10 og lette stedspecifikke interaktioner med antivirale CV-N-derivater omkring det andet N-bundne glykosyleringssted på HA-hoveddomænet (HA-top med 4 N-bundne glycaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellem glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helixdipol manifesterede god stabilitet af både modelpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjælp af SPR. Hvis sammenlignet med at genkende et enkelt kemisk syntetiseret glykosyleringssted på HA10 ved direkte at hæmme receptorbinding på glycandelene, viser det sig, at en højere affinitet af en fire-site muteret Fc-struktur til dens receptor fremkalder effektorfunktioner in vivo, hvilket afslører, at den ikke-relaterede sammensætning af N-bundne glycaner bundet til Fc-mutant er mekanisk bestemt13.
CV-N viser antiviral aktivitet mod HIV 14,15, influenza16 og Ebola-virus, som medieres af nanomolær binding til oligosaccharidmodifikationer med høj mannose på kuvert spike-proteiner12,17,18,19. Influenza HA-binding til et kulhydratbindingssted med høj affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent bundet dimerisk CVN2 bestemmes til at have ligevægtsdissociationskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og KD = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en anden en eller to kulhydratbindingssteder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolære område (KD = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA udviser affiniteter fra K D = 34 nM til KD = 5,7 nM (A / New York / 55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt er målrettet mod glycaner med høj mannose på de virale konvolutter, hæmmer yderligere replikation af hepatitis C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og mæslingevirus22.
Det lille CV-N-molekyle er blevet undersøgt grundigt i mere end 20 år, da det funktionaliserer for at binde en bred vifte af vira for at hæmme viral indgang16,18. Strukturelle analyser og bindende affinitetsassays indikerer tværbinding af to L’er i en domænebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i det mikromolære område for at øge aviditeten til virale kuvertglycoproteiner10,19. Selektiv binding af Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-arme og Man(9) omfatter to bindingssteder med forskellige affiniteter placeret på modsatte proteinprotomerer20 og derved når nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 betragtes således som et pseudoantistof vedrørende dets anvendelse til at binde epitoper på HIV gp120, svarende til virusneutraliserende antistoffer17. Heri er forfatteren interesseret i at undersøge den potentielle binding af CVN2 til SARS-CoV-2-spidsen via dets receptorbindende domæne (RBD). Bindingskurver af immobiliseret humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i KD = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraktion23.
I modsætning hertil genkender udvalgte immunglobulinklasser specifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som giver et substrat til affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regioner24. CV-N viser meget potent aktivitet i næsten alle influenza A- og B-vira16, og det er et bredt neutraliserende antiviralt middel. Vores viden er ufuldstændig om placeringen af målrettede epitoper på stammen af HA1 og HA2, der muligvis involverer epitopstrukturer til glycan-målretning ved stærkt neutraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding25.
Figur 1: Skematisk repræsentation af SPR-bindingsassay for CV-N til viruskuvertspidser. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA-protein i fuld længde (90 kDa). Kinetisk datasæt (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM), der viser dobbeltrefereret binding i realtid til influenza HA A/New York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobiliseret ligand DM inden for et koncentrationsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er fremhævet med gult. H-rester er fremhævet med gråt. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i vildtypeproteinet og gør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger Klik her for at se en større version af denne figur.
Mens glycanskjoldet på den membrandistale HA-topdel inducerer binding med høj affinitet til CV-N 12, er CVN2-binding til HA ved siden af en disulfidbro af HA-topdelen yderligere blevet observeret på dens steder med lav affinitet10,12. Forskellige polære interaktioner og interaktionssteder identificeres i kulhydratbinding af CV-N. Disse interaktioner verificeres ved at generere knock-out-varianter i bindingsstedet for at korrelere bindingsaffiniteter til in silico forudsagt glykosylering12. Projektet sigter således mod at sammenligne tidligere testede kemisk mannosylerede HA-peptider i bindingsaffinitet og specificitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterede 2019-nCoV-pigge og SARS-CoV-2, naturligt forekommende modificeret af et lille antal forskellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjælp af kryo-elektronmikroskopi og bindende assays rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistof, S309, der potentielt genkender en epitop på SARS-CoV-2 spike-protein indeholdende en konserveret glycan i Sarbecovirus-undergenus uden at konkurrere med receptorbinding26. Protokollen for denne undersøgelse beskriver, hvordan design, udtryk og karakterisering af CV-N-varianter er vigtige for at studere, hvordan CV-N og CVN2 binder til glykosylerede proteiner og syntetiske mannosylerede peptider ved hjælp af SPR-teknologien10,12.
Tandembundet dimer CVN2L027 og bindingsstedsvarianter (V2-V5) udtrykkes rekombinant, og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Der fremstilles også en mutant med en enkeltpunktsmutation E41A, fordi denne position er blevet set som en intermolekylær krydskontaktrest. Denne mutant er et andet interessant molekyle til SPR-bindingsmålinger mellem lektin- og højmannoseoligosaccharider, der dechifrerer bindingsdomæner og tillader sammenligning med den dimere form. Den domænebyttede krystalstruktur af CVN2 viser en fleksibel linker, der strækker sig mellem 49 og 54 rester. De to domæner kan fortsætte med at bevæge sig rundt om hængslet som stive legemer og udvikle enten en monomer gennem intramolekylære domæneinteraktioner (domæne A -rester 1-39; 90-101- med domæne B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domænebytte [domæne A (af den første monomer) med domæne B (af den anden) og domæne B (af den første monomer) med domæne A (af den anden kopi)]. Der er ingen tætte interaktioner mellem de to protomerers A- og B-domæner, bortset fra Glu4128. Genet for CV-N kan udvikles ved hjælp af en gentagen PCR-metode med 40-mer syntetiserede oligoer29 og subklones derefter i NdeI- og BamHI-stederne i pET11a til transformation (elektroporation) til elektrokompetente celler som beskrevet af Keeffe, J.R.27. Proteinet, der bruges til at opnå den respektive krystalstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderer et N-terminal 6-histidinrensningsmærke efterfulgt af et Faktor Xa protease-spaltningssted. Site-rettet mutagenese bruges til at lave punktmutationer, skifte kodoner og indsætte eller slette enkelte eller flere baser eller kodoner til aminosyreudveksling. Disse transformationer giver uvurderlig indsigt i proteinfunktion og struktur. Rekombinant udtrykt og oprenset CV-N, CVN2 og CVN3 er blevet biofysisk godt undersøgt20,21,27, er billige at producere og bruges derfor til at karakterisere bindende assays til glycaner immobiliseret på SPR-sensorchips. Konventionel enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) giver mindre reproducerbarhed vedrørende immobiliseringsteknikken for glycanligander og omdanner realtidsbinding af forskellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktsassays.
Binding-affinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt fold af homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) udtrykkes med et His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-søjle under anvendelse af affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosyleret HA-peptid og dimannosyleret HA-peptid ved anvendelse af SPR. Kemisk mannosylerede peptider eller HA- og S-protein er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflade via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme procedure for sekventielle kørsler anvendes på disse ligander, idet forskellige fortyndinger af CV-N og varianter af CV-N (og CVN2) injiceres for at opnå kinetisk information til molekylære interaktionsanalyser som beskrevet nedenfor30. RBD-immobiliseret SPR-sensorchip bruges til bindingsundersøgelser af CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med den humane ACE2.
CV-N’s bindingsaffinitet er korreleret med antallet af funktionelle bindingssteder [2H på domæner B og 2L på domæne(r) A, når de konstrueres som domænebyttet dimer]. En variant med en ændret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil fold af CV-N bestående af en disulfidbro-knock-out) udtrykkes i E. coli, renses og testes positivt for binding til HA-protein (H3N2) ved anvendelse af SPR10 og viser en konformationsændring ved binding af HA med enten H eller L kulhydratbin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren anerkender Dr. Christian Derntl fra Institut for Bioteknologi og Mikrobiologi ved TU Wien og Institut for Medicin III, Division of Nephrology and Dialysis ved Medical University of Vienna, især Dr. Markus Wahrmann for teknisk og videnskabelig støtte. Proteinekspression i pattedyrceller blev støttet af Institut for Bioteknologi ved University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Forfatteren ønsker at udtrykke sin dybe anerkendelse til Dr. Nico Dankbar fra XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, for nyttige videnskabelige diskussioner om udførelse af SPR-bindende assays.
Äkta primeplus | Cytiva | ||
Amicon tubes | Merck | C7715 | |
Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
DTT | Merck | DTT-RO | |
EDC | Merck | 39391 | |
EDTA | Merck | E9884 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
Glycine HCl | Merck | 55097 | |
HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
HEPES | Merck | H3375 | |
His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
Imidazole | Merck | I2399 | |
IPTG | Merck | I6758 | |
Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
LB agar | Merck | 52062 | |
LB agar | Merck | 19344 | |
LB Lennox | Merck | L3022 | |
Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
NaH2P04 | Merck | S0751 | |
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
NaOH | Merck | S5881 | |
NHS | Merck | 130672 | |
NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
PBS | Merck | 806552 | |
PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
Peptone | Merck | 70171 | |
pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
SDS | Merck | 11667289001 | |
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
Sodim chloride | Merck | S9888 | |
Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
Triton-X100 | Merck | T8787 | |
Tryptone | Merck | 93657 | |
Tween20 | Merck | P1379 | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
X-gal | Merck | XGAL-RO | |
XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
Yeast extract | Merck | Y1625 |