عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مبسطا لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) عن عيون الفئران بطريقة تدريجية. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح عيون الفئران ، يليه عزل خلايا RPE وبذرها وزراعتها.
Abstract
تقع طبقة الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) خلف المستقبلات الضوئية مباشرة وتؤوي نظاما استقلابيا معقدا يلعب العديد من الأدوار الحاسمة في الحفاظ على وظيفة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن هيكل RPE ووظيفته ضروريان للحفاظ على الرؤية الطبيعية. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا راسخا لعزل خلايا RPE الأولية للماوس. عزل RPE هو أداة رائعة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض RPE في نماذج الفئران المختلفة لاضطرابات العين. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد عزل RPE في مقارنة خلايا RPE الأولية للفئران المعزولة من الفئران البرية والمعدلة وراثيا ، وكذلك اختبار الأدوية التي يمكن أن تسرع من تطوير العلاج للاضطرابات البصرية. تقدم المخطوطة بروتوكول عزل RPE خطوة بخطوة. يستغرق الإجراء بأكمله ، من النوى إلى البذر ، حوالي 4 ساعات. لا ينبغي تغيير الوسائط لمدة 5-7 أيام بعد البذر ، للسماح بنمو الخلايا المعزولة دون اضطراب. ويتبع هذه العملية توصيف المورفولوجيا والتصبغ وعلامات محددة في الخلايا عن طريق التألق المناعي. يمكن تمرير الخلايا بحد أقصى ثلاث أو أربع مرات.
Introduction
تقع خلايا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) بين المشيمية والشبكية العصبية ، وتشكل طبقة أحادية بسيطة من الخلايا التكعيبية التي تقع خلف خلايا المستقبلات الضوئية (PR)1. يلعب RPE دورا حاسما في الحفاظ على بيئة صحية لخلايا العلاقات العامة ، وذلك أساسا عن طريق الحد من التراكم المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وما يترتب على ذلك من أضرار مؤكسدة1. تشرف خلايا RPE على العديد من الوظائف ، مثل تحويل وتخزين الرتينويدات ، وامتصاص الضوء المتناثر ، ونقل السوائل والأيونات ، وكثرة البلعمة في غشاء الجزء الخارجي من PR 2,3. يمكن أن تؤدي التغيرات في RPE (المورفولوجيا / الوظيفة) إلى إضعاف وظيفتها مما يؤدي إلى اعتلال الشبكية وهذه سمة مشتركة بين العديد من اضطرابات العين4. ترتبط العديد من أمراض العين بتغيرات في مورفولوجيا ووظيفة خلايا RPE ، بما في ذلك بعض الأمراض الوراثية مثل التهاب الشبكية الصباغي ، وداء الأذنين الخلقي ، والمهق4،5،6 ، بالإضافة إلى اضطرابات العين المرتبطة بالعمر مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) 7,8 . الخلايا البشرية هي الأكثر استحسانا ، وبالتالي سيكون من المثالي دراسة اضطرابات RPE في خلايا RPE البشرية الأولية لتشكيل طبقات RPE الأحادية. ومع ذلك ، فإن المسائل الأخلاقية ومحدودية توافر المتبرعين من البشر يرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم هذه الاضطرابات تؤدي إلى المراضة9 ، ولكن ليس بالضرورة الوفيات10 ، وبالتالي منع عزل خلايا RPE البشرية الأولية. وهذا يجعل زراعة خلايا RPE من متبرعين حيوانيين غير بشريين بديلا مفضلا. تعتبر القوارض ، وخاصة الفئران ، نموذجا رائعا لدراسة أمراض العين المختلفة نظرا لأن التكنولوجيا المعدلة وراثيا مثبتة على نطاق أوسع في هذه الأنواع11. على الرغم من أن استخدام خلايا RPE الأولية المستزرعة يوفر العديد من المزايا ، فقد كان من الصعب الحفاظ على الخلايا المتنامية للعديد من الممرات ، أو تخزين الخلايا وإعادة استخدامها. القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو عمر الفئران. يجب أن تكون الفئران المستخدمة لعزل RPE في سن مبكرة جدا (18-21 يوما هي الأمثل) حيث كان من الصعب زراعة خلايا RPE من الفئران البالغة11،12،13. يمكن عزل خلايا RPE عن عيون الفئران في أي عمر ، ولكن ما يصل إلى أربعة ممرات خلوية كانت ناجحة فقط مع الفئران الصغيرة (18-21 يوما). تم إجراء عزل RPE من شبكية العين الفئران ، باستخدام كل من الفئران C57BL6 والفئران المعدلة وراثيا مع حذف مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDARs) في خلايا RPE ، لدراسة تأثير الحمض الأميني المرتفع الحمض الأميني على تطور وتطور AMD14. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت خلايا RPE الأولية المعزولة في اقتراح هدف علاجي ل AMD عن طريق تثبيط NMDARs في خلايا RPE14. هناك بعض حاصرات NMDAR التي تمت الموافقة عليها من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) وتستخدم حاليا لعلاج الارتباك المعتدل إلى الشديد (الخرف) المرتبط بمرض الزهايمر (AD) ، مثل الميمانتين16 ، والذي يمكن أن يكون هدفا علاجيا محتملا ل AMD14. علاوة على ذلك ، تم استخدام خلايا RPE الأولية المعزولة للفئران للكشف عن العلامات الالتهابية والحث المقترح للالتهاب كآلية أساسية للميزات التي يسببها الحمض الأميني من AMD و AD باستخدام فأر معدل وراثيا (CBS) ، والذي يقدم مستوى عال من الحمض الأميني16,17.
تم استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا RPE عن كل من الفئران C57BL/6 من النوع البري والفئران المعدلة وراثيا التي تم تطويرها في مختبرنا كتكييف مبسط لبروتوكولات العزل المنشورة الأخرى13،18،19 للوصول إلى بروتوكول سهل التطبيق وموثوق به. لا يوجد تفضيل جنسي في هذا البروتوكول. في حين أن أعمار الفئران ضرورية لعملية العزل ، فقد تم استخدام الفئران الصغيرة والمسنين (18-21 يوما) والفئران الأكبر سنا في أي عمر (حتى 12 شهرا) لعزل RPE. ومع ذلك ، لاحظنا أن خلايا RPE المعزولة عن الفئران الصغيرة عاشت لفترة أطول ، ويمكن إجراء ما يصل إلى أربعة ممرات. يمكن تمرير خلايا RPE المعزولة من الفئران الأكبر سنا مرة أو مرتين ، ثم تتوقف عن النمو بمعدل طبيعي وتغير شكلها لتكون أكثر استطالة (خلايا تشبه الخلايا الليفية ). كما لوحظ فقدان التصبغ وانخفاض الالتصاق بصفيحة زراعة الأنسجة متبوعا بانفصال.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الحالي هو إجراء مفصل تم الإبلاغ عنه وتعديله وتبسيطه لعزل RPE عن عيون الماوس. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح وجمع وبذر وزراعة وتوصيف خلايا RPE المعزولة عن عيون الفئران.
هناك بعض القيود والخطوات الحاسمة التي يجب الوفاء بها لعزل RPE بنجاح ، مثل عمر الفئران ، وعدد العيو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون (NEI) ، صندوق المعهد الوطني للعيون (NEI) R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
References
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
