Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen
Summary
Die elektronische präresonanzstimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen ist eine neue Plattform für die hochgradig gemultiplexte Epitop-basierte Proteinbildgebung. Hier stellen wir einen praktischen Leitfaden vor, der die Antikörpervorbereitung, die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage und die EPR-SRS-Gewebebildgebung umfasst.
Abstract
Die Visualisierung einer Vielzahl spezifischer Biomarker in Geweben spielt eine wichtige Rolle bei der Erforschung der komplizierten Organisationen komplexer biologischer Systeme. Daher werden stark gemultiplexte Bildgebungstechnologien zunehmend geschätzt. Hier beschreiben wir eine aufstrebende Plattform der hochgemultiplexten Schwingungsbildgebung spezifischer Proteine mit vergleichbarer Empfindlichkeit gegenüber Standard-Immunfluoreszenz über elektronische präresonanzregenerierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen. Diese Methode umgeht die Grenze der spektral auflösbaren Kanäle in der konventionellen Immunfluoreszenz und bietet einen optischen One-Shot-Ansatz, um mehrere Marker in Geweben mit subzellulärer Auflösung abzufragen. Es ist im Allgemeinen kompatibel mit Standard-Gewebepräparaten, einschließlich paraformaldehydfixiertem Gewebe, gefrorenem Gewebe und formalinfixiertem paraffineingebettetem (FFPE) menschlichem Gewebe. Wir gehen davon aus, dass diese Plattform ein umfassenderes Bild der Proteininteraktionen biologischer Proben liefern wird, insbesondere für dickes intaktes Gewebe. Dieses Protokoll bietet den Workflow von der Antikörpervorbereitung über die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage bis hin zur EPR-SRS-Gewebebildgebung.
Introduction
Komplexe Gewebesysteme bestehen aus unterschiedlichen zellulären Subpopulationen, deren räumliche Standorte und Interaktionsnetzwerke mit ihren Funktionen und Funktionsstörungen tief verflochten sind 1,2. Um die Gewebearchitektur aufzudecken und ihre Komplexität zu hinterfragen, ist die Kenntnis der räumlichen Positionen von Proteinen bei Einzelzellauflösung unerlässlich. Daher wurden stark gemultiplexte Protein-Bildgebungstechnologien zunehmend geschätzt und könnten zu einem Eckpfeiler für die Untersuchung der Gewebebiologie werden 3,4,5. Aktuelle gängige gemultiplexte Proteinbildgebungsverfahren können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden. Eine ist die serielle Immunfluoreszenzbildgebung, die auf mehreren Runden der Gewebefärbung und Bildgebung beruht, und die andere ist die Bildgebung der Massenzytometrie in Verbindung mit Schwermetall-markierten Antikörpern 6,7,8,9,10,11,12.
Hier wird eine alternative Strategie für die Multiplex-Antikörper-basierte Proteinbildgebung vorgestellt. Im Gegensatz zur vorherrschenden Fluoreszenzbildgebungsmodalität, die aufgrund der breiten Anregungs- und Emissionsspektren nur 4-5 Kanäle gleichzeitig visualisieren kann (volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) ~ 500 cm-1), weist die Raman-Mikroskopie eine viel engere spektrale Linienbreite (FWHM ~ 10 cm-1) auf und bietet daher eine skalierbare Multiplexie. Vor kurzem wurde durch die Nutzung des engen Spektrums ein neuartiges Schema der Raman-Mikroskopie namens elektronische Präresonanz-stimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) -Mikroskopie entwickelt, das eine leistungsstarke Strategie für die Multiplex-Bildgebung13 bietet. Durch die Untersuchung der elektronisch gekoppelten Schwingungsmoden von Raman-Farbstoffen erreicht epr-SRS einen drastischen Verstärkungseffekt von 10 13-fach auf Raman-Querschnitte und überwindet den Empfindlichkeitsengpass der konventionellen Raman-Mikroskopie (Abbildung 1A)13,14,15. Infolgedessen wurde die Nachweisgrenze von epr-SRS auf sub-μM angehoben, was den Raman-Nachweis interessanter molekularer Marker wie spezifischer Proteine und Organellen in Zellenermöglicht 13,16. Insbesondere unter Verwendung von Raman-Farbstoff-konjugierten Antikörpern wurde die epr-SRS-Bildgebung spezifischer Proteine in Zellen und Geweben (Immuno-EprSRS genannt) mit einer vergleichbaren Empfindlichkeit gegenüber der Standard-Immunfluoreszenz gezeigt (Abbildung 1B)13,17. Durch die Abstimmung der Pumpenwellenlänge um nur 2 nm wird das epr-SRS-Signal vollständig ausgeschaltet (Abbildung 1B), was einen hohen Schwingungskontrast zeigt.
Auf der Sondenseite wurde eine Reihe von regenbogenartigen Raman-Sonden namens Manhattan Raman scattering (MARS) -Farbstoffe für die Antikörperkonjugation13,18,19,20 entwickelt. Diese einzigartige Raman-Palette besteht aus neuartigen Farbstoffen mit π-konjugierten Dreifachbindungen (Supplementary Material), die jeweils einen einzelnen und schmalen epr-SRS-Peak im bioorthogonalen Raman-Spektralbereich aufweisen (Abbildung 1C). Durch Modifikation der Struktur des Kernchromophors und isotopische Bearbeitung beider Atome der Dreifachbindung (Ergänzungsmaterial) wurden spektral getrennte Raman-Sonden entwickelt. Durch die Nutzung der skalierbaren Multiplexität bietet die epr-SRS-Mikroskopie in Verbindung mit der MARS-Farbstoffpalette eine optische Strategie für die One-Shot-Multiplexprotein-Bildgebung in Zellen und Geweben.
Immuno-eprSRS bietet eine alternative Strategie zu aktuellen Multiplex-Protein-Bildgebungsverfahren mit einzigartigen Stärken. Im Vergleich zu Fluoreszenzansätzen mit zyklischer Färbung, Bildgebung und Signalentfernung gewährleistet diese Raman-basierte Plattform eine Einzelrundenfärbung und Bildgebung. Daher umgeht es die praktische Komplexität zyklischer Verfahren und vereinfacht das Protokoll weitgehend, wodurch neue Gebiete der multiplexten Proteinbildgebung erschlossen werden. Zum Beispiel wurde Immuno-eprSRS unter Verwendung eines auf Raman-Farbstoffe zugeschnittenen Gewebereinigungsprotokolls auf drei Dimensionen erweitert, um hochgradig gemultiplexte Proteinkartierungen in dicken intakten Gewebenzu ermöglichen 17. Über 10 Proteinziele wurden entlang des millimeterdicken Gehirngewebesder Maus sichtbar gemacht 17. In jüngerer Zeit wurde auch die Kopplung von Immun-eprSRS mit einem optimierten Biomolekül-Retentionsexpansionsmikroskopie-Protokoll (ExM)21, einer nanoskaligen One-Shot-Bildgebung mehrerer Ziele,gezeigt 22. Im Vergleich zur abbildenden Massenspektroskopie 4,9 ist epr-SRS zerstörungsfrei und verfügt über eine intrinsisch optische Schnittfähigkeit. Darüber hinaus ist epr-SRS beim Gewebescannen zeiteffizienter. Typischerweise benötigt eine Geweberegion von 0,25 mm2 mit einer Pixelgröße von 0,5 μm nur wenige Minuten, um einen einzelnen epr-SRS-Kanal abzubilden. Beispielsweise beträgt die Gesamtabbildungszeit von vier SRS-Kanälen plus vier Fluoreszenzkanälen in Abbildung 4 etwa 10 min.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir das Immuno-eprSRS-Protokoll vor, das allgemein auf gängige Gewebetypen anwendbar ist, einschließlich frisch konservierter Mausgewebe, menschlicher FFPE-Gewebe und gefrorener Mausgewebe. Immuno-eprSRS wurde für ein Panel von Epitopen in Zellen und Geweben validiert, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Diese One-Shot-Plattform eignet sich besonders für Anwendungen, bei denen zyklische Strategien nicht gut funktionieren. Zum Beispiel ist die zyklische Fluoreszenz für dickes Gewebe anspruchsv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ruth A. Singer und Richard K.P. Benninger für die Bereitstellung von Bauchspeicheldrüsengewebe für die Maus. W.M. dankt der Unterstützung von NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) und US Army (W911NF-19-1-0214).
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465 (2017).
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- . Coherent Raman Scattering Microscope Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022)
