تصوير الأنسجة متعددة الإرسال للغاية باستخدام أصباغ رامان
Summary
يعد التصوير الإلكتروني الذي يحفز بالأشعة قبل الرنين (epr-SRS) لأصباغ رامان الشبيهة بقوس قزح منصة جديدة لتصوير البروتين القائم على الظهارة متعددة الإرسال للغاية. هنا ، نقدم دليلا عمليا بما في ذلك إعداد الأجسام المضادة ، وتلطيخ عينات الأنسجة ، وتجميع مجهر SRS ، وتصوير أنسجة epr-SRS.
Abstract
يلعب تصور نطاق واسع من المؤشرات الحيوية المحددة في الأنسجة دورا حيويا في استكشاف المنظمات المعقدة للأنظمة البيولوجية المعقدة. وبالتالي ، فقد تم تقدير تقنيات التصوير متعددة الإرسال بشكل متزايد. هنا ، نصف منصة ناشئة للتصوير الاهتزازي متعدد الإرسال للغاية لبروتينات محددة ذات حساسية مماثلة للتألق المناعي القياسي عبر التصوير الإلكتروني قبل الرنين الذي يحفز رامان (epr-SRS) لأصباغ رامان الشبيهة بقوس قزح. تتحايل هذه الطريقة على حد القنوات القابلة للحل طيفيا في التألق المناعي التقليدي وتوفر نهجا بصريا من طلقة واحدة لاستجواب علامات متعددة في الأنسجة ذات الدقة دون الخلوية. وهو متوافق بشكل عام مع مستحضرات الأنسجة القياسية ، بما في ذلك الأنسجة الثابتة بارافورمالديهايد ، والأنسجة المجمدة ، والأنسجة البشرية المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE). نتوقع أن توفر هذه المنصة صورة أكثر شمولا لتفاعلات البروتين للعينات البيولوجية ، خاصة بالنسبة للأنسجة السليمة السميكة. يوفر هذا البروتوكول سير العمل من إعداد الأجسام المضادة إلى تلطيخ عينات الأنسجة ، إلى تجميع مجهر SRS ، إلى تصوير أنسجة epr-SRS.
Introduction
تتكون أنظمة الأنسجة المعقدة من مجموعات فرعية خلوية متميزة تتشابك مواقعها المكانية وشبكات التفاعل بعمق مع وظائفها واختلالاتها 1,2. للكشف عن بنية الأنسجة واستجواب تعقيدها ، من الضروري معرفة المواقع المكانية للبروتينات بدقة خلية واحدة. وبالتالي ، فإن تقنيات تصوير البروتين متعددة الإرسال للغاية قد تم تقديرها بشكل متزايد ويمكن أن تصبح حجر الزاوية لدراسة بيولوجيا الأنسجة3،4،5. يمكن تصنيف طرق تصوير البروتين متعددة الإرسال الشائعة الحالية إلى فئتين رئيسيتين. أحدهما هو التصوير المناعي التسلسلي الذي يعتمد على جولات متعددة من تلطيخ الأنسجة والتصوير ، والآخر هو تصوير قياس الكتلة الخلوية إلى جانب الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن الثقيلة6،7،8،9،10،11،12.
هنا ، يتم تقديم استراتيجية بديلة لتصوير البروتين القائم على الأجسام المضادة متعددة الإرسال. على عكس طريقة التصوير الفلوري السائدة ، والتي يمكنها فقط تصور 4-5 قنوات في وقت واحد بسبب أطياف الإثارة والانبعاثات الواسعة (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) ~ 500 cm-1) ، يعرض مجهر Raman عرض خط طيفي أضيق بكثير (FWHM ~ 10 cm-1) وبالتالي يوفر تعدد الإرسال القابل للتطوير. في الآونة الأخيرة ، من خلال تسخير الطيف الضيق ، تم تطوير مخطط جديد لمجهر رامان يسمى الفحص المجهري الإلكتروني قبل الرنين الذي يحفز رامان (epr-SRS) ، مما يوفر استراتيجية قوية للتصوير متعدد الإرسال13. من خلال فحص أوضاع الاهتزاز المقترنة إلكترونيا لأصباغ رامان ، يحقق epr-SRS تأثيرا تعزيزيا جذريا يبلغ 10 13 ضعفا على مقاطع رامان العرضية ويتغلب على عنق الزجاجة الحساس لمجهر رامان التقليدي (الشكل 1A)13،14،15. ونتيجة لذلك ، تم دفع حد الكشف عن epr-SRS إلى sub-μM ، مما يمكن رامان من اكتشاف العلامات الجزيئية المثيرة للاهتمام مثل البروتينات والعضيات المحددة داخل الخلايا13,16. على وجه الخصوص ، باستخدام الأجسام المضادة المترافقة مع صبغة رامان ، تم إثبات تصوير epr-SRS لبروتينات محددة في الخلايا والأنسجة (تسمى eprSRS المناعية) بحساسية مماثلة للتألق المناعي القياسي (الشكل 1B)13,17. من خلال ضبط الطول الموجي للمضخة بمقدار 2 نانومتر فقط ، ستكون إشارة epr-SRS متوقفة تماما (الشكل 1B) ، والتي تعرض تباينا اهتزازيا عاليا.
على جانب المسبار ، تم تطوير مجموعة من مجسات رامان الشبيهة بقوس قزح تسمى أصباغ تشتت مانهاتن رامان (MARS) لاقتران الأجسام المضادة13،18،19،20. تتكون لوحة رامان الفريدة هذه من أصباغ جديدة تحمل روابط ثلاثية مترافقة π (مادة تكميلية) ، يعرض كل منها ذروة epr-SRS واحدة وضيقة في نطاق رامان الطيفي المتعامد الحيوي (الشكل 1C). من خلال تعديل بنية الكروموفور الأساسي وتحرير ذرتي الرابطة الثلاثية (المادة التكميلية) بشكل نظائري، تم تطوير مجسات رامان المنفصلة طيفيا. من خلال الاستفادة من تعدد الإرسال القابل للتطوير ، يوفر الفحص المجهري epr-SRS إلى جانب لوحة صبغة MARS استراتيجية بصرية لتصوير البروتين متعدد الإرسال بلقطة واحدة في الخلايا والأنسجة.
يوفر Immuno-eprSRS استراتيجية بديلة لطرق تصوير البروتين متعدد الإرسال الحالية ذات نقاط القوة الفريدة. بالمقارنة مع نهج التألق مع التلطيخ الدوري والتصوير وإزالة الإشارات ، تضمن هذه المنصة القائمة على Raman تلطيخا وتصويرا أحادي الجولة. لذلك ، فإنه يتحايل على التعقيد العملي في الإجراءات الدورية ويبسط البروتوكول إلى حد كبير ، وبالتالي يفتح مناطق جديدة لتصوير البروتين متعدد الإرسالات. على سبيل المثال ، من خلال تسخير بروتوكول إزالة الأنسجة المصمم خصيصا لصبغة رامان ، تم توسيع نطاق المناعي eprSRS إلى ثلاثة أبعاد لرسم خرائط البروتين متعددة الإرسال للغاية في الأنسجة السليمة السميكة17. تم تصور أكثر من 10 أهداف بروتينية على طول أنسجة دماغ الفئران التي يبلغ سمكها ملليمترا17. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا عرض اقتران المناعي eprSRS مع بروتوكول مجهر توسيع الاحتفاظ بالجزيئات الحيوية (ExM)المحسن 21 ، والتصوير النانوي بطلقة واحدة لأهداف متعددة22. بالمقارنة مع التحليل الطيفي الكتلي للتصوير 4,9 ، فإن epr-SRS غير مدمر ولديه قدرة تقسيم بصرية جوهرية. علاوة على ذلك ، فإن epr-SRS أكثر كفاءة في الوقت في مسح الأنسجة. عادة ، تستغرق منطقة الأنسجة التي تبلغ 0.25 مم2 بحجم بكسل 0.5 ميكرومتر بضع دقائق فقط للتصوير لقناة epr-SRS واحدة. على سبيل المثال ، يبلغ إجمالي وقت التصوير لأربع قنوات SRS بالإضافة إلى أربع قنوات فلورية في الشكل 4 حوالي 10 دقائق.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكول eprSRS المناعي الذي ينطبق على نطاق واسع على أنواع الأنسجة الشائعة ، بما في ذلك أنسجة الفئران المحفوظة حديثا ، والأنسجة البشرية FFPE ، وأنسجة الفئران المجمدة. تم التحقق من صحة Immuno-eprSRS لمجموعة من الظواهر في الخلايا والأنسجة ، كما هو موضح في الجدول 1. هذه المنصة ذات الل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر روث أ. سينجر وريتشارد كيه بي بينينجر على تزويدهما بأنسجة البنكرياس الفأرية. يقر W.M. بالدعم المقدم من NIH R01 (GM128214) و R01 (GM132860) و R01 (EB029523) والجيش الأمريكي (W911NF-19-1-0214).
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465 (2017).
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- . Coherent Raman Scattering Microscope Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022)
