Evaluering av substrat Ubiquitylation av E3 Ubiquitin-ligase i pattedyrcellelysater
Summary
Vi tilbyr en detaljert protokoll for en ubiquityleringsanalyse av et bestemt substrat og en E3 ubiquitin-ligase i pattedyrceller. HEK293T-cellelinjer ble brukt til proteinoverekspresjon, det polyubiquitylerte substratet ble renset fra cellelysater ved immunprecipitasjon og løst i SDS-PAGE. Immunoblotting ble brukt til å visualisere denne posttranslasjonelle modifikasjonen.
Abstract
Ubiquitylering er en posttranslasjonell modifikasjon som skjer i eukaryote celler som er kritisk for regulering av flere biologiske veier, inkludert celleoverlevelse, proliferasjon og differensiering. Det er en reversibel prosess som består av en kovalent festing av ubiquitin til substratet gjennom en kaskadereaksjon av minst tre forskjellige enzymer, sammensatt av E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerende enzym) og E3 (Ubiquitin-ligase enzym). E3-komplekset spiller en viktig rolle i substratgjenkjenning og ubiquitylering. Her beskrives en protokoll for å evaluere substrat ubiquitylering i pattedyrceller ved hjelp av forbigående koinfeksjon av et plasmid som koder for det valgte substratet, en E3 ubiquitin-ligase og et merket ubiquitin. Før lysis behandles de transfekterte cellene med proteasomhemmeren MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) for å unngå substratproteasomal nedbrytning. Videre sendes celleekstraktet til småskala immunoprecipitation (IP) for å rense det polyubiquitylerte substratet for påvisning ved vestlig blotting (WB) ved bruk av spesifikke antistoffer for ubiquitin-tag. Derfor er en konsistent og ukomplisert protokoll for ubiquityleringsanalyse i pattedyrceller beskrevet for å hjelpe forskere med å adressere ubiquitylering av spesifikke substrater og E3 ubiquitin ligaser.
Introduction
Posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) er en viktig mekanisme for proteinregulering, noe som er viktig for cellehomeostase. Protein ubiquitylation er en dynamisk og intrikat modifikasjon som skaper et utvalg av forskjellige signaler som resulterer i flere cellulære utfall i eukaryote organismer. Ubiquitylering er en reversibel prosess som består i feste av et ubiquitinprotein som inneholder 76 aminosyrer til substratet, som forekommer i en enzymatisk kaskade sammensatt av tre forskjellige reaksjoner1. Det første trinnet er karakterisert ved ubiquitinaktivering, som avhenger av en ATP-hydrolyse for å danne et høyenergi-tioesterbundet ubiquitin mellom ubiquitin C-terminalen og cysteinresten som er tilstede i det aktive stedet for E1-enzymet. Deretter overføres ubiquitinet til E2-enzymet og danner et thioester-lignende kompleks med ubiquitin. Etterpå er ubiquitin kovalent festet til substratet av E2, eller oftere, av E3-enzymet, som gjenkjenner og interagerer med substratet 2,3. Av og til er E4-enzymer (Ubiquitin-kjedeforlengelsesfaktorer) nødvendige for å fremme multiubiquitinkjedemontering3.
Ubiquitin har syv lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63), noe som tillater dannelsen av polyubiquitinkjeder som genererer forskjellige koblinger for å produsere forskjellige tredimensjonale strukturer som kommer til å bli gjenkjent av flere effektorproteiner 4,5. Derfor er den typen polyubiquitinkjede som introduseres i substratet avgjørende for å bestemme celleskjebta 6,7,8. Videre kan substratet ogsåubiquitineres gjennom sine N-terminale rester kalt N-degroner. Spesifikke E3 ubiquitin-ligaser er ansvarlige for N-degron-gjenkjenning, noe som tillater polyubiquitylering av nærliggende lysinrester9.
I dag er det mer enn 40 forskjellige SCF-spesifikke substrater karakterisert. Blant disse kan nøkkelregulatorer av flere biologiske veier, inkludert celledifferensiering og utvikling, samt celleoverlevelse og død, bli funnet 10,11,12,13. Dermed er identifisering av spesifikke substrater for hver E3 ubiquitin-ligase avgjørende for å designe et omfattende kart over ulike biologiske hendelser. Selv om identifisering av ekte substrater er biokjemisk utfordrende, er bruk av biokjemibaserte metoder svært godt egnet til å evaluere kjedespesifisitet og skillet mellom mono- og polyubiquitylering14. Denne studien beskriver en komplett protokoll for ubiquityleringsanalyse ved bruk av pattedyrcellelinjen HEK293T som overuttrykker substratet UXT-V2 (allestedsnærværende uttrykt prefoldinlignende chaperone isoform 2) med E3 ubiquitin-ligasekomplekset SCF (Fbxo7). UXT-V2 er en viktig kofaktor for NF-κB-signalering, og når dette proteinet er slått ned i celler, hemmer det TNF-α-indusert NF-κB-aktivering11. For å oppdage polyubiquitylert UXT-V2 brukes proteasomhemmeren MG132 siden den har evnen til å blokkere den proteolytiske aktiviteten til 26S-underenheten i proteasomkomplekset15. Videre sendes celleekstraktet til en liten IP for å rense substratet, ved å bruke et spesifikt antistoff immobilisert til agaroseharpiks for påfølgende påvisning av WB ved bruk av utvalgte antistoffer. Denne protokollen er svært nyttig for å validere substrat ubiquitylation i det cellulære miljøet, og den kan også tilpasses for forskjellige typer pattedyrceller og andre E3 ubiquitin-ligase komplekser. Det er imidlertid nødvendig å validere substratet som er testet gjennom en in vitro ubiquityleringsanalyse også, siden begge protokollene utfyller hverandre med hensyn til identifisering av sanne substrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitylering er en viktig posttranslasjonell modifikasjon som regulerer nivåene av flere proteiner og spiller en avgjørende rolle i mange signalveier og biologiske prosesser, og sikrer et sunt intracellulært miljø. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) er et av hovedfokusene i nyere farmasøytisk forskning, og gir mulighet for å stabilisere tumorundertrykkere eller indusere nedbrytning av onkogene produkter22. For eksempel fremmer avvikende proliferasjon av plasmacelle-neoplasmer som er ansvarl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T støttes av FAPESP-tilskuddsnummer 2020/15771-6 og CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P og V.S støttes av CAPES. C.R.S.T.B.C ble støttet av FAPESP-stipendnummer 2019/23466-1. Vi takker Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) for den materielle støtten.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
References
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson’s disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -. H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
