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Biochemistry

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63561
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Abstract

La ubiquitilación es una modificación post-traduccional que ocurre en las células eucariotas que es crítica para la regulación de varias vías biológicas, incluida la supervivencia, proliferación y diferenciación celular. Es un proceso reversible que consiste en una unión covalente de ubiquitina al sustrato a través de una reacción en cascada de al menos tres enzimas diferentes, compuestas de E1 (enzima de activación de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de ubiquitina) y E3 (enzima ubiquitina-ligasa). El complejo E3 juega un papel importante en el reconocimiento y ubiquitilación del sustrato. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la ubiquitilación del sustrato en células de mamíferos utilizando la coinfección transitoria de un plásmido que codifica el sustrato seleccionado, una ubiquitina ligasa E3 y una ubiquitina etiquetada. Antes de la lisis, las células transfectadas se tratan con el inhibidor del proteasoma MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) para evitar la degradación proteasómica del sustrato. Además, el extracto celular se somete a inmunoprecipitación a pequeña escala (IP) para purificar el sustrato poliubiquitilado para su posterior detección por western blotting (WB) utilizando anticuerpos específicos para la etiqueta de ubiquitina. Por lo tanto, se describe un protocolo consistente y sin complicaciones para el ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos para ayudar a los científicos a abordar la ubiquitilación de sustratos específicos y las ligasas de ubiquitina E3.

Introduction

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) son un mecanismo importante con respecto a la regulación de proteínas, que es esencial para la homeostasis celular. La ubiquitilación de proteínas es una modificación dinámica e intrincada que crea una variedad de señales diferentes que resultan en varios resultados celulares en organismos eucariotas. La ubiquitilación es un proceso reversible que consiste en la unión de una proteína de ubiquitina que contiene 76 aminoácidos al sustrato, que se produce en una cascada enzimática compuesta por tres reacciones distintas1. El primer paso se caracteriza por la activación de la ubiquitina, que depende de una hidrólisis de ATP para formar una ubiquitina ligada al tioéster de alta energía entre la ubiquitina C-terminal y el residuo de cisteína presente en el sitio activo de la enzima E1. Posteriormente, la ubiquitina se transfiere a la enzima E2 formando un complejo similar al tioéster con la ubiquitina. Después, la ubiquitina se une covalentemente al sustrato por la E2, o más a menudo, por la enzima E3, que reconoce e interactúa con el sustrato 2,3. Ocasionalmente, las enzimas E4 (factores de elongación de la cadena de ubiquitina) son necesarias para promover el ensamblaje de la cadena de multiubiquitina3.

La ubiquitina tiene siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63), lo que permite la formación de cadenas de poliubiquitina que generan enlaces distintos para producir diferentes estructuras tridimensionales que van a ser reconocidas por varias proteínas efectoras 4,5. Por lo tanto, el tipo de cadena de poliubiquitina introducida en el sustrato es esencial para decidir su destino celular 6,7,8. Además, el sustrato también podría ser ubiquitinado a través de sus residuos N-terminales llamados N-degrons. Las ubiquitinas-ligasas específicas E3 son responsables del reconocimiento de N-degron, lo que permite la poliubiquitilación del residuo de lisina cercano9.

Hoy en día, hay más de 40 sustratos diferentes específicos de SCF caracterizados. Entre ellos, se pueden encontrar reguladores clave de varias vías biológicas, incluida la diferenciación y el desarrollo celular, así como la supervivencia y la muerte celular, 10,11,12,13. Por lo tanto, la identificación de sustratos específicos de cada ubiquitina-ligasa E3 es esencial para diseñar un mapa completo de diversos eventos biológicos. A pesar de que la identificación de sustratos verdaderos es bioquímicamente desafiante, el uso de métodos basados en la bioquímica es muy adecuado para evaluar la especificidad de la cadena y la distinción entre mono y poliubiquitilación14. Este estudio describe un protocolo completo para el ensayo de ubiquitilación utilizando la línea celular de mamíferos HEK293T que sobreexpresa el sustrato UXT-V2 (isoforma 2 de chaperona similar a la prefoldina expresada ubicuamente) con el complejo E3 ubiquitina-ligasa SCF (Fbxo7). UXT-V2 es un cofactor esencial para la señalización de NF-κB, y una vez que esta proteína es derribada en las células, inhibe la activación de NF-κB inducida por TNF-α11. Así, para detectar UXT-V2 poliubiquitilado, se utiliza el inhibidor del proteasoma MG132 ya que tiene la capacidad de bloquear la actividad proteolítica de la subunidad 26S del complejo proteasoma15. Además, el extracto celular se somete a una IP a pequeña escala para purificar el sustrato, utilizando un anticuerpo específico inmovilizado a resina de agarosa para su posterior detección por WB utilizando anticuerpos seleccionados. Este protocolo es muy útil para validar la ubiquitilación del sustrato en el entorno celular, y también se puede adaptar para diferentes tipos de células de mamíferos y otros complejos de ubiquitina-ligasa E3. Sin embargo, es necesario validar el sustrato probado a través de un ensayo de ubiquitilación in vitro también, ya que ambos protocolos se complementan entre sí en cuanto a la identificación de sustratos verdaderos.

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Protocol

NOTA: En la Figura 1 se representa una descripción general del protocolo de ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos.

Figure 1
Figura 1. Descripción general del procedimiento de ensayo de ubiquitilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Cultivo celular

  1. Cultivar la línea celular HEK293T en una placa de cultivo tratada con TC de 100 mm a una confluencia del 80%-90% en los medios de crecimiento (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) alta glucosa suplementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina (100 unidades), estreptomicina (100 μg) y L-glutamina (0,292 mg/ml)). Incubar el cultivo a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.
  2. Para pasar las células, aspire los medios de la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica. Lave las células una vez con 1 ml de solución salina esterilizada 1x tamponada con fosfato (PBS 1x).
  3. Separe las células agregando 1 ml de solución de tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Incubar el plato a 37 °C durante 5 min. Resuspend las células utilizando una pipeta serológica en 2 ml de medios de crecimiento.
  4. Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado. Resusped suavemente el pellet celular en 3 ml de medios de crecimiento mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión celular homogénea.
  5. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a una placa de cultivo tratada con TC de 100 mm que contenga 9 ml de medios de crecimiento.
    NOTA: Si las células están en buenas condiciones, cada plato de cultivo de HEK293T, en el que la confluencia es del 80%-90%, puede generar tres platos de cultivo con 80% de confluencia 2 días después del paso.

2. Transfección celular

NOTA: No se recomienda transfectar el cultivo celular si la confluencia alcanzada es inferior al 80%.

  1. Antes de la transfección, certifique si las células están libres de contaminación y en una confluencia adecuada para las transfecciones transitorias.
  2. Para cada muestra de transfección, prepare los complejos ADN-Polietilenimina (PEI 1 μg/μL a pH 7.2) de la siguiente manera:
    1. Diluir 3 μg de cada plásmido en 100 μL de medio sérico reducido opti-MEM I sin suplementación y mezclarlo suavemente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo.
      NOTA: Aquí, las células fueron transfectadas con 4 μg de cada plásmido: Vector vacío (pcDNA3) o FLAG-Fbxo7 constructos y UXT-V2-HA, con o sin 6xHis-myc-ubiquitin. El contenido total de ADN fue de 12 μg.
    2. Descongele el PEI en RT y agréguelo a la solución siguiendo una proporción de 3 μL de PEI por 1 μg de ADN. Homogeneizar la solución mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Luego incubarlo durante 15 min en RT para permitir la formación de complejos ADN-PEI.
      NOTA: La proporción óptima de volumen de PEI por cantidad de ADN difiere según la línea celular seleccionada.
  3. Agregue el volumen total de complejos de ADN-PEI a cada plato que contenga el cultivo celular y mézclelo suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.
  4. Reemplace el medio de crecimiento después de 5 h, ya que la exposición prolongada a PEI puede ser tóxica para las células HEK293T. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2 durante 36 h.

3. Lisis celular e inmunoprecipitación

  1. Después del período de incubación y 6 h antes de la lisis celular, tratar las células transfectadas con 10 μM del inhibidor del proteasoma MG-132. Una vez más, incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.
  2. Aspirar el medio de cada plato de cultivo utilizando una pipeta serológica y lavarlo una vez con 1 mL de 1x PBS. Separe las células añadiendo 1 ml de tripsina e incubando el plato a 37 °C durante 5 min. Resuspend las células en 1 mL de medios de crecimiento.
  3. Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 minutos a RT.
  4. Retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado. Resuspender suavemente el pellet celular en 200 μL de tampón de lisis NP-40 helado (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl y 1% NP-40), complementado con el cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (10 mM NaF y 1 mM Na3VO4), y transferir la solución a un microtubo limpio de 1.5 mL.
  5. Incubar el lisado celular durante 30 min sobre hielo. Después de la incubación, centrifugar los lisados celulares a 16.900 x g durante 20 min a 4 °C.
  6. Mientras tanto, equilibre las perlas de agarosa-anti-HA con un tampón de lisis NP-40 helado. Utilice 15 μL de perlas de agarosa-anti-HA para cada muestra. Lavar las perlas con 200 μL de tampón de lisis NP-40 pulsiéndolo en un tubo de microcentrífuga a 3.000 x g durante 1 min a 4 °C. Con una pipeta, aspira y desecha el sobrenadante con mucho cuidado; repita este proceso tres veces. Después, mantenga las cuentas equilibradas en hielo hasta su uso.
  7. Después de centrifugar los lisados celulares, recupere el sobrenadante. Cuantificar el contenido de proteínas en el lisado total utilizando el método de Bradford16.
  8. Asegurar que cada muestra sometida a inmunoprecipitación presente una cantidad igual de proteína. Incubar el volumen necesario de lisado celular con las perlas equilibradas de agarosa-anti-HA durante 4 h, girando suavemente en una incubadora giratoria a 4 °C, lo que permite que el UXT-V2-HA se una a las perlas de agarosa-anti-HA.
  9. Recoge las perlas de agarosa-anti-HA pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 x g durante 1 min a 4 °C. Aspira con cuidado y desecha el sobrenadante. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis de células NP-40 helado y dos veces con tampón FLAG/HA helado (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl y 0.1% NP-40).
  10. Después del lavado final, retire todo el sobrenadante con cuidado con una pipeta y eluya la proteína poliubiquitilada con péptido HA (300 μg / ml) diluido en tampón FLAG / HA. Incubar las perlas de agarosa-anti-HA con péptido HA durante 1 h a 4 °C en una plataforma agitadora de balanceo.
  11. Girar las perlas a 3.000 x g durante 2 min a 4 °C y pipetear cuidadosamente el sobrenadante que contiene las proteínas poliubiquitinadas. Si es necesario, guarde el eluido en un microtubo fresco y limpio a -20 °C.
  12. Resolver los eluidos y los lisados celulares en SDS-PAGE al 10% (electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida)17 e inmunoblotting.
  13. En este estudio, se realizó una transferencia húmeda wb. Para este tipo de transferencia, coloque el gel en un sándwich de transferencia compuesto de papel de filtro-gel-membrana-papel de filtro, acolcharlo con almohadillas y presionarlo junto con una rejilla de soporte. Coloque este sistema verticalmente en un tanque lleno de tampón de transferencia y entre electrodos de alambre de acero inoxidable / platino. La transferencia ocurre durante 90 min a 150 V en tampón de transferencia húmeda (glicina 192 mM, tris-base 25 mM, 0.025% SDS, 20% metanol).
    NOTA: Dado que los extractos celulares fueron cuantificados (paso 3.7), ejecute un SDS-PAGE con una cantidad igual de proteína para cada muestra. Además, para resolver el eluido, ejecute volúmenes iguales de cada muestra.
  14. Sondear la membrana de immunoblot utilizando anticuerpos seleccionados 11. Asegúrese de que se detecta una señal de frotis en el eluido del sustrato poliubiquitilado extraído en el proceso IP mediante el uso de anticuerpos anti-myc en las muestras que contienen la ligasa E3 de tipo salvaje, el sustrato y myc-ub. En el lisado celular (entrada), asegúrese de que se detecte la señal del sustrato elegido, la proteína Fbxo7, las proteínas ubiquitiladas y una proteína de limpieza (por ejemplo, GAPDH y β-actina) para garantizar la misma cantidad de proteínas en cada carril.
    NOTA: La dilución de cada anticuerpo utilizado se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Representative Results

UXT (transcripción expresada ubicuamente) es una proteína similar a la prefoldina que forma complejos de plegamiento de proteínas expresados ubicuamente en tejidos de ratones y humanos como el corazón, el cerebro, el músculo esquelético, la placenta, el páncreas, el riñón y el hígado18. Se han descrito dos isoformas de empalme de UXT, que se denominan UXT-V1 y UXT-V2, que realizan funciones distintas y ubicaciones subcelulares. UXT-V1 se localiza predominantemente en el citoplasma y en el interior de las mitocondrias, y está implicado en la apoptosis inducida por TNF-α y la formación de señalosomas antivirales19,20. La mayoría de las investigaciones se han centrado en UXT-V2 que se localiza principalmente en el núcleo y actúa como un cofactor para múltiples factores transcripcionales involucrados en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y en las vías inflamatorias. UXT-V2 está involucrado en la vía de señalización NF-κB trabajando como un coactivador esencial en el potencosoma NF-κB21. Se demostró que UXT-V2 es un sustrato canónico de la ubiquitina ligasa E3 SCF(Fbxo7), mediando su poliubiquitilación y degradación por el proteasoma, y en consecuencia inhibiendo la vía de señalización NF-κB11.

La poliubiquitilación específica de UXT-V2-HA mediada por Fbxo7 en células se observó después de sondear el eluido de anti-HA IP con un anticuerpo anti-myc, que detecta el myc-ub conjugado al sustrato (Figura 2). La especificidad de anti-myc para sustrato poliubiquitilado se visualizó en los carriles 1 y 2 (Figura 2), en los que no se detectó un frotis de proteínas poliubiquitiladas cuando las células fueron co-transfectadas con Fbxo7 y myc-ub en ausencia de plásmido UXT-V2-HA (Figura 2, carril 1). Además, no se visualizó ningún frotis correspondiente a la poliubiquitinación proteica en la combinación de Fbxo7 y UXT-V2-HA sin el plásmido myc-ub (Figura 2, carril 2). Para demostrar que la poliubiquitilación de UXT-V2 estaba mediada por Fbxo7, se transfectó un vector vacío pcDNA3, fbxo7 de tipo salvaje fbxo7 o fbxo7-ΔF-box mutante, que no puede ensamblar el complejo SCF activo debido a la ausencia del dominio F-box responsable de la interacción con SKP1, en combinación con UXT-V2-HA y myc-ub. Se observó una fuerte señal de frotis de UXT-V2 poliubiquitilado solo en presencia del Fbxo7 de tipo salvaje (Figura 2, carril 4), lo que sugiere que UXT-V2 fue poliubiquitilado por el complejo SCF (Fbxo7) en las células en comparación con los controles (Figura 2, carriles 3 y 5). La presencia de una débil señal de frotis de UXT-V2 poliubiquitilado en presencia de estos controles negativos podría indicar la acción de Fbxo7 endógeno u otra actividad de ubiquitina-ligasa E3.

Figure 2
Figura 2. Ensayo de Ubiquitilación en células: Transfección transitoria de células HEK293T con los plásmidos indicados. Después de la lisis celular, los extractos celulares (entradas) fueron inmunoprecipitados con perlas de agarosa-anti-HA. Las muestras eluidas y de entrada fueron resueltas por SDS-PAGE, y el western blot fue sondeado con anticuerpos específicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La ubiquitilación es una modificación post-traduccional esencial que regula los niveles de varias proteínas y desempeña un papel crucial en muchas vías de señalización y procesos biológicos, asegurando un entorno intracelular saludable. El sistema ubiquitina-proteasoma (SAI) es uno de los principales focos de la investigación farmacéutica reciente, proporcionando la posibilidad de estabilizar supresores tumorales o inducir la degradación de productos oncogénicos22. Por ejemplo, la proliferación aberrante de neoplasias de células plasmáticas responsables de la secreción de inmunoglobulina monoclonal en el mieloma múltiple (MM) promueve una vía fisiopatológica debido a la acumulación de proteínas mal plegadas y/o desplegadas en el retículo endoplásmico (RE)23. Una vez que ocurre este estrés de ER, activa varios procesos, incluida la activación del sistema ubiquitina-proteasoma. El uso de inhibidores del proteasoma (bortezomib, carfilzomib e ixazomib) para inducir la acumulación de proteínas y la consiguiente muerte celular para el tratamiento del mieloma múltiple mostró resultados prometedores como fármaco antitumoral al reducir la progresión de la enfermedad en pacientes de alto riesgo24,25. Por otra parte, se dirigen otros esfuerzos centrados en la estabilidad proteica, como los inhibidores de la ubiquitina-ligasa E3 MDM2 que mostraron una gran capacidad para evitar la ubiquitilación de p53, evitando así su degradación a través del proteasoma26. Por lo tanto, ha surgido una nueva era de investigación farmacéutica / biomédica centrada en la comprensión y el control de la UPS como método para combatir la enfermedad.

Este estudio describe un método para analizar la ubiquitilación de una proteína diana específica por una ubiquitina-ligasa E3 dada en un entorno celular. En este ensayo, un número significativo de células se coinfectan transitoriamente con plásmidos seleccionados que codifican para un sustrato de proteína marcado, una ligasa E3 y una ubiquitina etiquetada. Antes de la lisis, las células deben ser tratadas con un inhibidor del proteasoma para permitir la acumulación de proteínas poliubiquitiladas que sufrirían degradación en el proteasoma. Para obtener una muestra menos compleja, se inmunoprecipitó la proteína diana y se analizó su poliubiquitilación mediante WB utilizando anticuerpos específicos basados en la etiqueta de ubiquitina.

La cantidad de proteína en cada muestra y las perlas de agarosa deben normalizarse para permitir la comparación de datos entre esas muestras. Se detectó una señal de frotis de alta intensidad de poliubiquitilación UXT-V2 en presencia de la ubiquitina-ligasa E3 de tipo salvaje. A pesar de que la señal obtenida de la proteína objetivo, la ligasa E3 y la ubiquitina podría ser de origen endógeno, el uso de proteínas recombinantes tiene la ventaja de un mayor rendimiento y detección de señales en el análisis de WB. Además, el uso de la ligasa E3 de tipo salvaje y su mutante permite el análisis específico de su actividad en el sustrato, que es un control esencial para este experimento. Se observó que el mutante Fbxo7 (Fbxo7-ΔF-box) no podía promover la poliubiquitilación de UXT-V2, lo que sugiere que la señal de frotis detectada en presencia del Fbxo7 de tipo salvaje era específica. Además, es importante observar que en ausencia del sustrato marcado o myc-ub, no se detectó el frotis poliubiquitilado, lo que indica la especificidad de la agarosa-anti-HA utilizada. El uso de un anticuerpo anti-ubiquitina para sondear el eluido del sustrato IP podría detectar una señal de frotis poliubiquitilado incluso en los controles negativos, ya que las proteínas inespecíficas o las proteínas asociadas indirectas del objetivo también se pueden eludir junto con el sustrato. Una vez que estas proteínas inespecíficas pueden ser poliubiquitiladas, la alta sensibilidad de la anti-ubiquitina puede detectarlas.

También hay algunas variaciones para este protocolo con respecto a la transfección de plásmidos, el tampón de lisis celular, el anticuerpo de inmunoprecipitación y el sondeo WB. La IP presentada aquí se desarrolló con anticuerpos anti-HA para precipitar el sustrato, y la membrana WB se sondeó con anticuerpos anti-myc para visualizar la señal de ubiquitina. La transfección de ubiquitina-HA e IP con anti-HA y WB sondeando la membrana con una etiqueta anti-sustrato o anti-sustrato también es una alternativa para esta metodología. Sin embargo, la inmunoprecipitación de la ubiquitina podría traer un gran número de proteínas poliubiquitiladas inespecíficas además de las proteínas de unión a la ubiquitina. En este caso, se recomienda utilizar el tampón RIPA (tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación) durante la lisis celular para minimizar estas proteínas no deseadas27. Sin embargo, es esencial evaluar si el protocolo IP es compatible con el búfer RIPA. Además, la poliubiquitilación del sustrato podría perjudicar la unión del anticuerpo a este objetivo específico al bloquear el epítopo conformacional. Por lo tanto, la aplicación de anticuerpos con anti-tag es más confiable.

Si bien este enfoque es muy útil para la purificación de proteínas solubles, presenta algunas limitaciones. En primer lugar, se pudo observar la acción de ubiquitina-ligasas endógenas E3 inespecíficas. Para superar este problema y confirmar la especificidad de la ubiquitilación objetivo en las células, es esencial realizar también un ensayo de ubiquitilación in vitro utilizando complejo de ligasa E3 purificado y sustrato seleccionado, además de enzimas E1 y E2, ubiquitina, tampón de ubiquitina y ATP, que están disponibles comercialmente. Otra limitación de este método se produce cuando la sobreexpresión de la proteína diana provoca un efecto citotóxico que culmina en una reducción de la viabilidad celular. En esta situación, se recomienda el uso de la diana de proteína endógena para la inmunoprecipitación. Además, como se mencionó anteriormente, este protocolo es adecuado para la extracción de proteínas solubles; por lo tanto, no puede extraer proteínas unidas a la membrana, por ejemplo. Ya sea que el sustrato probado sea una proteína de membrana, el tampón RIPA podría reemplazar el tampón de lisis NP-40 descrito aquí si el protocolo IP no se ve comprometido por él. En este protocolo, el foco del aclaramiento de proteínas es el sistema ubiquitina-proteasoma, que explica que solo se utilizó el inhibidor del proteasoma. Sin embargo, numerosas proteínas solubles sufren degradación a través de la autofagia en el lisosoma. En consecuencia, el uso de un inhibidor del lisosoma, como la bafilomicina A1, también podría ser necesario para bloquear la autofagia de fase tardía debido a la H+-ATPasa28 vacuolar.

Dado que la ubiquitilación es un proceso reversible, la ubiquitina puede eliminarse del sustrato mediante la actividad catalítica de las deubiquitinasas (DUB); este es uno de los principales obstáculos a la hora de caracterizar los sustratos de ubiquitina-ligasa E329. La acción de los DUB aumenta la discriminación del sustrato en este tipo de experimentos una vez que disminuye los tiempos de permanencia de la poliubiquitilación en algunos objetivos30. Por lo tanto, sería beneficioso tratar las células con inhibidores de la deubiquitinasa para evitar este problema. La diafonía positiva o negativa también podría influir en el destino de un sustrato específico. Ya está establecido que las modificaciones post-traduccionales (PTM) pueden diafonía en varios escenarios, y la fosforilación, por ejemplo, puede regular la ubiquitilación mediante la modulación de la actividad de la ubiquitina-ligasa E3, promoviendo el reconocimiento del sustrato por ligasas E3 o mediante la regulación del sustrato y la interacción de la ligasa E3 al afectar su localización celular31 . Esto podría ser un problema al elegir la línea celular en la que se ejecutará el experimento. Si las señales que son requisitos previos para la ubiquitilación están ausentes en la línea celular deseable, se requiere seleccionar una línea celular alternativa para realizar el análisis o inducir la señal en la línea celular seleccionada. Un problema común que puede ocurrir en los ensayos de ubiquitilación realizados en células es la muerte celular masiva después del tratamiento con MG132, que es causada principalmente por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que inducen la muerte celular apoptótica. Después de varias pruebas para estandarizar el protocolo, se encontró que un tratamiento ideal con MG132 para las células HEK293T no exceda las 6 h antes de la lisis a 10 μM de concentración. Este protocolo también es adecuado para otros tipos de células de mamíferos para identificar pares sustrato-E3 ubiquitina-ligasa; aunque, es crucial estandarizar el volumen de PEI utilizado en la transfección y el período de tratamiento con MG132 para la línea celular elegida.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Acknowledgments

F.R.T cuenta con el apoyo de la subvención FAPESP número 2020/15771-6 y CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P y V.S son compatibles con CAPES. C.R.S.T.B.C fue apoyado por la beca FAPESP número 2019/23466-1. Agradecemos a Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) por el apoyo material.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Axygen PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish Corning 430167
15 mL tube Corning 430766
96-well plate Cralplast 655111
Agarose-anti-HA beads Sigma-Aldrich E6779
Anti Mouse antibody Seracare 5220-0341 Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody Seracare 5220-0337 Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody Sigma-Aldrich A3853 Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody Sigma-Aldrich SAB1407251 Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody Sigma-Aldrich H3663 Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody Cell Signalling 2272 Dilution used: 1:1000
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500ML
BSA Sigma-Aldrich A9647-100G Bovine Serum Albumin
Cell incubator Nuaire NU-4850
Centrifuge Eppendorf 5804R 500 x g for 5 min
ChemiDoc BioRad
Digital pH meter Kasvi K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning 10-017-CRV High glucose
Fetal bovine serum Gibco F4135 Filtrate prior use
HA peptide Sigma-Aldrich I2149
HEK293T cells ATCC CRL-3216
Hepes Gibco 15630080
KCl VWR Life Science 0365-500G
Kline rotator Global Trade Technology GT-2OIBD
MG-132 Boston Biochem I-130
Microcentrifuge Eppendorf 5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane GE Healthcare 10600016
NP40 (IGEPAL CA-630) Sigma-Aldrich I8896-100ML
Optical microscope OPTIKA microscopes SN510768
Opti-MEM Gibco 31985-070
pcDNA3 Invitrogen V79020 For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x Gibco 10378-016
Phosphate buffered saline 10x AccuGENE 51226 To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6
Ponceau S VWR Life Science 0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST Sigma-Aldrich S8820
Rocking Shaker Kasvi 19010005
SDS-PAGE system BioRad 165-8004
Solution Homogenizer Phoenix Luferco AP-22
Trizma base Sigma-Aldrich T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express) Gibco 12605-028
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
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Bioquímica Número 183
Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos
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dos Passos, P. M. S., Spagnol, V.,… More

dos Passos, P. M. S., Spagnol, V., de Correia, C. R. S. T. B., Teixeira, F. R. Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates. J. Vis. Exp. (183), e63561, doi:10.3791/63561 (2022).

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