Denne artikel beskriver en metode til sterilisering af ormepluk, spatler og skalpeller ved hjælp af et mikroforbrændingsanlæg i stedet for åben ild.
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) er en optimal modelorganisme til forskning og uddannelse på primært bachelorinstitutioner. Undergraduates kan hurtigt lære den sterile teknik, der kræves for at opretholde C. elegans kulturer. Sterilisering af platinplukker, der bruges til at overføre orme fra en plade til en anden, sker traditionelt ved at holde pluk i en flamme fra en Bunsen-brænder eller ethanollanterne. Bunsen-brændere kræver dog en gaskilde, og begge dele udstyr udgør risikoen for utilsigtet brand i forbindelse med åben ild. Demonstreret her er en teknik til sterilisering af ormeplukker, spatler og skalpeller ved hjælp af et infrarødt bakteriologisk loop mikroforbrændingsanlæg. Dette udstyr kræver kun en stikkontakt og minimerer potentielle brandfarer. Ved at sænke risiko- og gaskravene er denne teknik velegnet til forskning og undervisning i en bachelorindstilling.
Modelorganismen C. elegans er velegnet til både forskning og uddannelse på primært bachelorinstitutioner (PUI’er) på grund af de lave omkostninger, nem vedligeholdelse og anvendelsesområde 1,2,3,4. For at håndtere orme – for eksempel at flytte en orm fra en plade til en anden, kan eksperimenter bruge en ormplukker. En række valg kan foretages eller købes til brug med C. elegans. Picks er oftest lavet ved hjælp af en platin eller platin / iridium spids, monteret i et glas, metal eller træ håndtag. Glashåndtag kan fremstilles internt ved at smelte en Pasteur-pipette rundt om en platintråd, indtil ledningen er fastgjort. Yderligere oplysninger om C. elegans husdyrhold, herunder hvordan man dyrker og vedligeholder orme og deres fødekilder, kan findes i WormBook5 og andre kilder 6,7,8.
Når man arbejder med C. elegans, anvendes aseptiske teknikker typisk til at forhindre forurening med mikrober og svampe. Eksempler på aseptiske teknikker omfatter sterilisering af instrumenter, autoklavering af reagenser og udførelse af arbejde i sterile felter. Ormeplukkere steriliseres typisk ved hjælp af en åben ild9. Derudover forbrænder sterilisering af ormeplukket orme og forhindrer dermed utilsigtede blandinger af stammer, når man arbejder med flere ormstammer. Typiske metoder til sterilisering af ormevalg involverer en åben ild fra enten en Bunsen-brænder, ethanollanterne eller standardlighter (tabel 1). Vi var motiverede til at søge sikrere alternativer til eksisterende metoder i laboratoriet, da en bachelorstuderende ubevidst spildte ethanol, mens han fyldte en ethanollanterne og ved et uheld startede en lille brand, da lanternen blev antændt. Desværre er der rapporteret om mange ulykker ved hjælp afethanollanterner 10,11,12. Heldigvis er alternative steriliseringsmetoder blevet valideret til brug i mikrobiologi, og formålet med denne artikel er at demonstrere, hvordan man bruger dette udstyr til at sterilisere instrumenter til brug med C. elegans.
I mikrobiologiske laboratorier er den aseptiske teknik også kritisk. Serologiske sløjfer og ledninger fremstillet af platin steriliseres enten ved hjælp af en åben ild13 eller et mikroforbrændingsanlæg 14,15,16. Andre navne på mikroforbrændingsanlæg omfatter mikrosterilisatorer eller bactoforbrændingsanlæg. Fordelene ved mikroforbrændingsanlægget i forhold til traditionelle flammemetoder inkluderer reduceret brandfare, eliminering af sprøjtning af forbrændingsmaterialer og evne til at arbejde i en laminær flowhætte / biosikkerhedsskab 16,17,18. Faktisk anbefaler både American Society of Microbiology og Verdenssundhedsorganisationen at bruge mikroforbrændingsanlæg frem for brugen af en åben ild 17,19,20. I sammenligning med Bunsen-brændere kræver mikroforbrændingsanlæg heller ikke en gasledning, som nogle laboratorier måske ikke har eller måske ikke har placeret ved hver bænk, som eleverne kan bruge. Inspireret af disse fordele blev der udviklet en protokol til at erstatte brugen af flamme med mikroforbrændingsanlæg til sterilisering af almindeligt anvendte instrumenter såsom plukker, spatler og skalpeller i C. elegans laboratoriet. Denne metode kan være hensigtsmæssig for instruktører og forskere, der søger at øge sikkerheden og / eller fleksibiliteten, når de arbejder med C. elegans.
C. elegans er en modelorganisme, der er velegnet til øvelser i bachelorundervisningslaboratorier. Brugen af mikroforbrændingsanlæg i stedet for åben ild giver fordele i både forskningslaboratorier og klasseværelseslaboratorier. Faktisk kan bachelor laboratoriekurser udgøre en højere risiko for utilsigtede brande i betragtning af antallet af nyuddannede forskere i rummet. Derudover øges risikoen for brand, når ethanol bruges til at sterilisere instrumenter nær flammekilden, da ethanoldampe er antændelige. Bærbarheden giver også en fordel for klasseværelser, hvor der ikke er installeret gasledninger ved hver bænk. Denne metode er blevet anvendt i undervisnings- og forskningslaboratorier på vores institution, hvilket resulterer i ingen stigninger i forurening og nul laboratoriesikkerhedsulykker siden dens inkorporering i 2016.
For at sikre kompatibilitet med mikroforbrændingsanlæg blev en række valg med forskellige monteringer, trådsammensætninger og trådmålere testet. Trådsammensætning omfattede 100% platin såvel som 90% platin / 10% iridium med en trådtykkelse på 30-32 G, og uanset tykkelse og sammensætning kompromitterede opvarmningsmetoden ikke trådintegriteten. Monteringerne omfattede to forskellige typer kommercielt tilgængelige plukhåndtag og internt fremstillede glasbeslag fra Pasteur-pipetter. Bemærk, at pluk ikke lyser rødglødende, som de gør i flammen. Imidlertid opnås tilstrækkelig sterilisering stadig, så længe sterilisatoren har nået den rette temperatur. Det er således vigtigt at lade mikroforbrændingsanlægget varme op i 10 eller 20 minutter, som angivet i producentens anvisninger. At holde instrumentet i kammeret i mindst 5 s for at opnå sterilisering er også kritisk. Hvis instrumentet efterlades i kammeret længere end 7 s, vil det ikke skade instrumentet, men det er unødvendigt. Selvom dette er en relativt ligetil procedure med minimale trin og sandsynligvis ikke har brug for fejlfinding, kan det tage lidt øvelse at lære at stabilisere instrumentet i tønden uden at røre siderne.
For at erstatte åben ild skal en steriliseringsmetode dække alle de anvendelser, der anvendes i et laboratorium. Ud over steriliseringsinstrumenter kan C. elegans laboratorier også bruge Bunsen-brændere til at skabe et sterilt felt til at udføre andre opgaver såsom hældning af plader eller inokulering af kulturer13. Men om dette skaber et sterilt felt eller trækker i stadig levedygtige forurenende stoffer forbliver kontroversielt14. Selvom det ikke er en mulighed på alle institutioner, kan et biosikkerhedsskab eller en laminær flowhætte bruges til disse formål, så et laboratorium kan fungere uden brug af åben ild. Brugsanvisninger til de fleste mikroforbrændingsanlæg anbefaler ikke brug til sterilisering af skalpelblade, fordi skrabning af de indre vægge beskadiger sterilisatoren. Men hvis man omhyggeligt bruger en guide, kan man sterilisere et skalpelblad eller spatel uden at røre ved de indre vægge. Dette udvider brugen af teknikken til at muliggøre chunking uden brug af en flamme og gør det muligt for et C. elegans laboratorium at fungere uden at skifte teknikker mellem sterilisering af forskellige genstande.
Som beskrevet i tabel 1 tilbyder mikroforbrændingsanlæg øget sikkerhed, øget kompatibilitet med laminære flowhætter og øget bærbarhed i forhold til flammebaserede metoder, men har begrænsninger. De er dyrere end de andre metoder og kræver en opvarmningstid, før steriliseringstemperaturerne opnås. Afslutningsvis kan denne metode, der rutinemæssigt anvendes i mange mikrobiologiske laboratorier, være anvendelig i nogle C. elegans forsknings- og undervisningslaboratorier, der søger at forbedre laboratoriesikkerheden uden at gå på kompromis med steriliteten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Suzanne Howard og Justin Finne. Dette arbejde blev finansieret af Wellesley College Neuroscience Department. N2-orme blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Publikationsgebyrerne for denne artikel blev støttet af Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
N2 worms | CGC | N2 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
Petri dish | Fisher | 08-772B | |
Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |