Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick Ex Vivo e vescicole extracellulari
Summary
Il presente protocollo descrive l’isolamento dei microRNA dalle ghiandole salivari delle zecche e dalle vescicole extracellulari purificate. Questa è una procedura universale che combina reagenti e forniture comunemente usati. Il metodo consente anche l’uso di un piccolo numero di zecche, con conseguente microRNA di qualità che possono essere facilmente sequenziati.
Abstract
Le zecche sono ectoparassiti importanti che possono veicolare più agenti patogeni. Le ghiandole salivari delle zecche sono essenziali per l’alimentazione in quanto la loro saliva contiene molti effettori con proprietà farmaceutiche che possono diminuire le risposte immunitarie dell’ospite e migliorare la trasmissione degli agenti patogeni. Un gruppo di tali effettori sono i microRNA (miRNA). I miRNA sono brevi sequenze non codificanti che regolano l’espressione del gene ospite all’interfaccia tick-host e all’interno degli organi del tick. Questi piccoli RNA vengono trasportati nella saliva delle zecche attraverso vescicole extracellulari (EV), che servono la comunicazione inter e intracellulare. Vescicole contenenti miRNA sono state identificate nella saliva delle zecche. Tuttavia, si sa poco sui ruoli e sui profili dei miRNA nelle vescicole salivari e nelle ghiandole delle zecche. Inoltre, lo studio delle vescicole e dei miRNA nella saliva delle zecche richiede procedure noiose per raccogliere la saliva delle zecche. Questo protocollo mira a sviluppare e convalidare un metodo per isolare i miRNA da vescicole extracellulari purificate prodotte da colture d’organo ex vivo . I materiali e la metodologia necessari per estrarre i miRNA dalle vescicole extracellulari e dalle ghiandole salivari delle zecche sono descritti qui.
Introduction
Le zecche sono ectoparassiti che trasportano molti agenti patogeni alla fauna selvatica, al bestiame, agli esseri umani e ai loro animali domestici 1,2. L’alimentazione delle zecche provoca una significativa perdita economica causando danni alla pelle, riducendo il peso e la produzione di latte a causa di una grave anemia e la trasmissione di agenti patogeni potenzialmente mortaliche causano malattie 1,3,4,5. Le attuali pratiche di controllo per la gestione delle popolazioni di zecche si concentrano sull’uso di acaricidi. Tuttavia, il continuo emergere di resistenza agli acaricidi nelle zecche che parassitano il bestiame 5,6, l’aumento dell’incidenza di punture di zecche7 e la trasmissione di agenti patogeni all’interno delle aree residenziali 8,9, hanno portato alla necessità di alternative uniche per il controllo delle zecche.
Le ghiandole salivari delle zecche sono organi essenziali che assicurano il successo biologico di una zecca. Sono formati da diversi tipi di acino (I, II, III e IV) con varie funzioni fisiologiche. Le ghiandole salivari sono responsabili dell’osmoregolazione, sia fuori che sull’ospite, restituendo l’eccesso di acqua e il contenuto di ferro all’ospite tramite salivazione 2,10. Gli acini di tipo I sono anche coinvolti nell’assorbimento di acqua dall’atmosfera mediante la secrezione di saliva igroscopica10,11. Le proteine effettrici salivari, come il cemento e le cistatine, sono prodotte all’interno delle cellule secretorie negli acini10,12 di tipo II e III. Gli acini di tipo I non influenzano l’alimentazione delle zecche, indicando che l’assunzione di farina di sangue non innesca cambiamenti morfologici e fisiologici in questi acini di tipo13,14. D’altra parte, gli Acini di tipo II e III si attivano durante l’alimentazione e presentano pochissima attività pre-attaccamento. Pertanto, l’alimentazione è necessaria per innescare l’allargamento delle cellule secretorie all’interno degli acini di tipo II e la produzione di composti bioattivi. Gli acini di tipo III sono di dimensioni ridotte durante l’alimentazione a causa della secrezione all’interno dei granuli secretori12.
Le ghiandole salivari sono anche il sito di infezione patogena nella zecca e nella via di trasmissione. Durante l’alimentazione, le zecche secernono diversi composti con effetti farmaceutici necessari per completare con successo la farina di sangue 10,15,16. Questi composti hanno proprietà antinfiammatorie, immunosoppressive e vasodilatatorie 10,15,17. Studi recenti hanno dimostrato che le vescicole extracellulari (EV) derivate dalle ghiandole salivari delle zecche ospitano molti di questi composti, inducendo effetti antinfiammatori e immunomodulatori 18,19,20. “Vescicole extracellulari” è un termine generico usato per descrivere vescicole classificate come esosomi e microvescicole in base alle loro dimensioni e biogenesi. Nel complesso, i veicoli elettrici sono bleb lipidici con membrane a doppio strato che sono ~ 40 nm-1 μm nella dimensione21; generalmente, gli esosomi sono descritti come di dimensioni 40-150 nm, mentre le microvescicole sono comprese tra 150 nm-1 μm in dimensioni 21,22,23. Tuttavia, la dimensione non è indicativa del percorso di biogenesi dei veicoli elettrici22.
La biogenesi degli esosomi inizia con l’invaginazione sequenziale della membrana plasmatica. Questa invaginazione porta alla formazione di corpi multivescicolari e infine provoca la deformazione della membrana vescicolare per azione di complessi ESCRT o sfingomielinasi (sMasi)24,25. Gli esosomi possono essere lisati all’interno dei lisosomi per mantenere l’omeostasi cellulare o uscire tramite fusione vescicolare alla membrana plasmatica per fornire costituenti cellulari alle cellule riceventi21,24. D’altra parte, le microvescicole sono formate dall’azione di flopassi e flipasses, cambiando la conformazione dei lipidi nella membrana plasmatica26. Gli EV sono essenziali per la comunicazione cellula-cellula, fungendo da sistema di trasporto per il carico intracellulare, come lipidi, proteine, acidi nucleici e microRNA (miRNA)21,27,28. Una volta trasportate, queste vescicole trasportano il loro carico nel citoplasma delle cellule riceventi, generando cambiamenti fenotipici nella cellula ricevente22,29. A causa dell’importanza delle vescicole extracellulari nell’alimentazione delle zecche e della manipolazione delle risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell’ospite18,20, il carico all’interno delle vescicole extracellulari presenta potenziali bersagli per lo sviluppo di terapie anti-zecche e un meccanismo unico per interrompere l’alimentazione delle zecche. Ciò include i miRNA all’interno delle ghiandole salivari delle zecche e delle vescicole extracellulari derivate dalla ghiandola salivare.
I miRNA sono brevi sequenze non codificanti, di lunghezza ~ 18-22 nucleotide (nt), che possono regolare, degradare o silenziare post-trascrizionalmente le sequenze di mRNA30,31. Durante la trascrizione, i pri-miRNA vengono scissi da Dicer (RNA polimerasi III) per formare una struttura distintiva simile a una forcina, diventando un pre-miRNA. Il pre-miRNA viene tagliato ancora una volta da Drosha (RNA polimerasi III) per formare un duplex di miRNA maturo. La sequenza matura si integra nel complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC) complementare alla sequenza di mRNA, causando la repressione della traduzione o la degradazione dell’mRNA 28,30,32. Durante l’alimentazione dell’ospite, i miRNA all’interno della saliva delle zecche possono modulare l’espressione del gene dell’ospite per sopprimere le risposte immunitarie e migliorare la trasmissione dei patogeni 33,34,35,36,37. Sebbene esistano studi approfonditi su veicoli elettrici e miRNA, il loro ruolo durante l’alimentazione all’interfaccia tick-host è ancora poco compreso. L’ottimizzazione dei protocolli che possono facilmente portare all’isolamento e alla purificazione di miRNA di alta qualità è fondamentale per far progredire le nostre conoscenze su questi argomenti.
Molteplici opzioni possono essere utilizzate per isolare i veicoli elettrici, come l’ultracentrifugazione, la precipitazione degli esosomi, la precipitazione dei polimeri, la cromatografia dell’immunoaffinità e le tecniche di esclusione basate sulle dimensioni38. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere tra esosomi o microvescicole. Pertanto, come accennato in precedenza, EV viene utilizzato come termine generico quando si isolano i veicoli elettrici da diversi campioni. Le vescicole isolate negli esperimenti qui descritti rappresentano una miscela di vescicole derivate da diverse vie di biogenesi. Un’ulteriore purificazione di una specifica popolazione di vescicole extracellulari può essere ottenuta mediante immunoprecipitazione utilizzando perline rivestite con anticorpi contro marcatori (cioè marcatori esosomiali, marcatori tumorali) unici per la popolazione di vescicole di interesse39,40. I miRNA possono anche essere estratti tramite diversi kit di isolamento disponibili in commercio 7,41,42.
L’obiettivo di questo progetto era quello di sviluppare un protocollo che combina metodi comunemente applicati per isolare i veicoli elettrici ed estrarre miRNA sia dai veicoli elettrici che dalle ghiandole salivari alimentate. Poiché la secrezione di composti bioattivi viene attivata alimentando12, le zecche dovrebbero essere autorizzate a nutrirsi per identificare i miRNA che possono essere importanti per manipolare le risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell’ospite. Il presente protocollo richiede un piccolo numero di zecche (20 zecche) per isolare i veicoli elettrici e i rispettivi miRNA, rispetto ad altri studi precedentemente descritti che richiedevano 2000 zecche43. Inoltre, evita la contaminazione delle secrezioni salivari con pilocarpina44, che potrebbe influenzare gli esperimenti che studiano l’effetto dei veicoli elettrici e dei loro miRNA sulle cellule ospiti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’attuale protocollo fornisce una metodologia dettagliata per l’estrazione di miRNA dalle ghiandole salivari e dai veicoli elettrici. Tuttavia, ci sono considerazioni importanti, che sono tutte dettagliate nelle note per ogni sezione di questo protocollo. La capsula e la rete a rete devono essere fissate durante l’alimentazione delle zecche per evitare che le zecche fuoriescano. La preparazione e il posizionamento della capsula sono descritti in Koga et al.40. Diverse repliche delle dissezioni del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo molto grati per l’assistenza del Cattle Fever tick Laboratory di Edimburgo, in Texas. Vorremmo ringraziare Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado e Homer Vasquez. Vorremmo anche riconoscere l’assistenza di Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario e Stephanie Guzman Valencia durante tutto il progetto. Vorremmo ringraziare il Texas A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group per il loro aiuto e consiglio durante la stesura di questo manoscritto. I seguenti reagenti sono stati forniti dai Centers for Disease Control and Prevention per la distribuzione da BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Le zecche femminili di I. scapularis sono state ricevute anche dalla Tick Rearing Facility dell’Oklahoma State University. Questo progetto è stato finanziato dalla Texas A & M University T3: triads for transformation grant e dall’accordo di cooperazione #58-3094-1-003 dall’USDA-ARS all’AOC.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
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