Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes
Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA’s uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA’s die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.
Abstract
Teken zijn belangrijke ectoparasieten die meerdere pathogenen kunnen overbrengen. De speekselklieren van teken zijn essentieel voor het voeden, omdat hun speeksel veel effectoren bevat met farmaceutische eigenschappen die de immuunrespons van de gastheer kunnen verminderen en de overdracht van ziekteverwekkers kunnen verbeteren. Een groep van dergelijke effectoren zijn microRNA’s (miRNA’s). miRNA’s zijn korte niet-coderende sequenties die de genexpressie van de gastheer reguleren op de teken-gastheerinterface en in de organen van de teek. Deze kleine RNA’s worden in het tekenspeeksel getransporteerd via extracellulaire blaasjes (EV’s), die inter- en intracellulaire communicatie dienen. Blaasjes met miRNA’s zijn geïdentificeerd in het speeksel van teken. Er is echter weinig bekend over de rollen en profielen van de miRNA’s in speekselblaasjes en -klieren. Bovendien vereist de studie van blaasjes en miRNA’s in tekenspeeksel vervelende procedures om tekenspeeksel te verzamelen. Dit protocol heeft tot doel een methode te ontwikkelen en te valideren voor het isoleren van miRNA’s van gezuiverde extracellulaire blaasjes geproduceerd door ex vivo orgaanculturen. De materialen en methodologie die nodig zijn om miRNA’s uit extracellulaire blaasjes en speekselklieren te extraheren, worden hierin beschreven.
Introduction
Teken zijn ectoparasieten die veel ziekteverwekkers overbrengen naar dieren in het wild, vee, mensen en hun huisdieren 1,2. Tekenvoeding resulteert in aanzienlijk economisch verlies door schade aan de huid te veroorzaken, het gewicht en de melkproductie te verminderen als gevolg van ernstige bloedarmoede en de overdracht van potentieel dodelijke ziekteverwekkende pathogenen 1,3,4,5. De huidige bestrijdingspraktijken voor het beheer van tekenpopulaties zijn gericht op het gebruik van acariciden. Niettemin hebben de voortdurende opkomst van acaricideresistentie bij teken die vee parasiteren 5,6, de verhoogde incidentie van tekenbeten7 en de overdracht van ziekteverwekkers binnen woonwijken 8,9, geleid tot een behoefte aan unieke tekenbestrijdingsalternatieven.
De speekselklieren zijn essentiële organen die zorgen voor het biologische succes van een teek. Ze worden gevormd door verschillende acinustypen (I, II, III en IV) met verschillende fysiologische functies. De speekselklieren zijn verantwoordelijk voor osmoregulatie, zowel uit als op de gastheer, door wateroverschot en ijzergehalte terug te geven aan de gastheer via speekselvloed 2,10. Type I acini zijn ook betrokken bij de opname van water uit de atmosfeer door de afscheiding van hygroscopisch speeksel10,11. Speekseleffectoreiwitten, zoals cement en cystatinen, worden geproduceerd in secretoire cellen in type II en III acini 10,12. Type I acini heeft geen invloed op de tekenvoeding, wat aangeeft dat de inname van bloedmeel geen morfologische en fysiologische veranderingen teweegbrengt bij deze acini type13,14. Aan de andere kant worden Acini type II en III geactiveerd tijdens het voeden en vertonen ze zeer weinig activiteit voorafgaand aan de hechting. Voeding is dus noodzakelijk om de vergroting van de secretoire cellen binnen type II acini en de productie van bioactieve stoffen te activeren. Type III acini worden tijdens het voeren verkleind als gevolg van de secretie in de secretoire korrels12.
De speekselklieren zijn ook de plaats van pathogene infectie in de teek en de transmissieroute. Tijdens het voeren scheiden teken verschillende verbindingen af met farmaceutische effecten die nodig zijn voor een succesvolle voltooiing van het bloedmeel 10,15,16. Deze verbindingen hebben ontstekingsremmende, immunosuppressieve en vaatverwijdende eigenschappen 10,15,17. Recente studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes (EV’s) afgeleid van teken speekselklieren verschillende van deze verbindingen bevatten, waardoor ontstekingsremmende en immunomodulerende effecten worden opgewekt 18,19,20. “Extracellulaire blaasjes” is een overkoepelende term die wordt gebruikt om blaasjes te beschrijven die zijn geclassificeerd als exosomen en microvesicles op basis van hun grootte en biogenese. Over het algemeen zijn EV’s lipide blebs met dubbellaagse membranen die ~ 40 nm-1 μm zijn in grootte21; over het algemeen worden exosomen beschreven als 40-150 nm groot, terwijl microvesicles tussen 150 nm-1 μm zijn in grootte 21,22,23. De grootte is echter niet indicatief voor de EVs biogenese route22.
De biogenese van exosomen begint met de sequentiële invaginatie van het plasmamembraan. Deze invaginatie leidt tot de vorming van multivesiculaire lichamen en resulteert uiteindelijk in de vervorming van het vesiculaire membraan door de werking van ESCRT-complexen of sfingomyelinases (sMases)24,25. De exosomen kunnen ofwel in de lysosomen worden gelyseerd om cellulaire homeostase te behouden of via vesiculaire fusie naar het plasmamembraan worden afgevoerd om cellulaire bestanddelen aan de ontvangende cellen te leveren21,24. Aan de andere kant worden microvesicles gevormd door de werking van flopasses en flipasses, waardoor de conformatie van lipiden in het plasmamembraan verandert26. EV’s zijn essentieel voor cel-naar-cel communicatie en dienen als een transportsysteem voor intracellulaire lading, zoals lipiden, eiwitten, nucleïnezuren en microRNA’s (miRNA’s)21,27,28. Eenmaal vervoerd, leveren deze blaasjes hun lading af in het cytoplasma van de ontvangende cellen, waardoor fenotypische veranderingen in de ontvangende cel worden gegenereerd22,29. Vanwege het belang van extracellulaire blaasjes bij het voeren van teken en de manipulatie van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer18,20, biedt de lading in extracellulaire blaasjes potentiële doelen voor de ontwikkeling van anti-tekentherapieën en een uniek mechanisme om tekenvoeding te verstoren. Dit omvat miRNA’s in teken speekselklieren en speekselklier-afgeleide extracellulaire blaasjes.
miRNA’s zijn korte niet-coderende sequenties, ~ 18-22 nucleotide (nt) lang, die post-transcriptioneel mRNA-sequenties kunnen reguleren, afbreken of dempen30,31. Tijdens transcriptie worden de pri-miRNA’s gesplitst door Dicer (RNA polymerase III) om een onderscheidende haarspeldachtige structuur te vormen en een pre-miRNA te worden. Het pre-miRNA wordt opnieuw gesneden door Drosha (RNA polymerase III) om een volwassen miRNA duplex te vormen. De volwassen sequentie wordt geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) complementair aan de mRNA-sequentie, waardoor translatierepressie of mRNA-afbraak 28,30,32 ontstaat. Tijdens het voeden van de gastheer kunnen miRNA’s in het speeksel van de teek de genexpressie van de gastheer moduleren om immuunresponsen te onderdrukken en de overdracht van pathogenente verbeteren 33,34,35,36,37. Hoewel er uitgebreide studies over EV’s en miRNA’s bestaan, zijn hun rollen tijdens het voeden op de tick-host-interface nog steeds slecht begrepen. Het optimaliseren van protocollen die gemakkelijk kunnen resulteren in de isolatie en zuivering van hoogwaardige miRNA’s is cruciaal voor het bevorderen van onze kennis over deze onderwerpen.
Meerdere opties kunnen worden gebruikt om EV’s te isoleren, zoals ultracentrifugatie, exosoomprecipitatie, polymeerprecipitatie, immunoaffiniteitschromatografie en op grootte gebaseerde uitsluitingstechnieken38. Deze technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen exosomen of microvesicles. Dus, zoals eerder vermeld, wordt EV gebruikt als een overkoepelende term bij het isoleren van EV’s uit verschillende monsters. De blaasjes die in de hierin beschreven experimenten worden geïsoleerd, vertegenwoordigen een mengsel van blaasjes die zijn afgeleid van verschillende biogeneseroutes. Verdere zuivering van een specifieke populatie van extracellulaire blaasjes kan worden bereikt door immunoprecipitatie met behulp van kralen bedekt met antilichamen tegen markers (d.w.z. exosomale markers, tumormarkers) die uniek zijn voor de blaasjespopulatie van belang 39,40. miRNA’s kunnen ook worden geëxtraheerd via verschillende in de handel verkrijgbare isolatiekits 7,41,42.
Het doel van dit project was om een protocol te ontwikkelen dat veelgebruikte methoden combineert om EV’s te isoleren en miRNA te extraheren uit zowel EV’s als speekselklieren. Omdat de afscheiding van bioactieve stoffen wordt geactiveerd door12 te voeren, moeten teken kunnen voeden om miRNA’s te identificeren die belangrijk kunnen zijn voor het manipuleren van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer. Het huidige protocol vereist een klein aantal teken (20 teken) om EV’s en hun respectieve miRNA’s te isoleren, vergeleken met andere eerder beschreven studies die 2000 teken43 vereisten. Verder vermijdt het de besmetting van speekselafscheidingen met pilocarpine44, wat van invloed kan zijn op experimenten die het effect van EV’s en hun miRNA’s op gastheercellen bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol biedt een gedetailleerde methodologie voor het extraheren van miRNA uit speekselklieren en EV’s. Er zijn echter belangrijke overwegingen, die allemaal worden beschreven in de opmerkingen voor elke sectie van dit protocol. De capsule en het gaas moeten tijdens het voeren van de teken worden vastgezet om te voorkomen dat teken ontsnappen. De voorbereiding en plaatsing van de capsule worden beschreven in Koga et al.40. Verschillende replica’s van de tekendissecties moeten worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn zeer dankbaar voor de hulp van het Cattle Fever tick Laboratory in Edinburg, Texas. We willen Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado en Homer Vasquez bedanken. We willen ook de hulp van Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario en Stephanie Guzman Valencia tijdens het project bedanken. We willen de Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group bedanken voor hun hulp en advies tijdens het schrijven van dit manuscript. De volgende reagentia werden geleverd door Centers for Disease Control and Prevention voor distributie door BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Vrouwelijke I. scapularis-teken werden ook ontvangen van de Tick Rearing Facility aan de Oklahoma State University. Dit project werd gefinancierd door Texas A&M University T3: triades voor transformatiesubsidie en de samenwerkingsovereenkomst #58-3094-1-003 door de USDA-ARS aan AOC.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
References
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
- de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
- Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , 603-672 (2019).
- Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
- Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
- Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
- Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
- Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
- Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
- Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
- Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
- Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
- Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
- Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
- Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
- Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
- Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
- Chávez, A. S. O., O’Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
- Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
- Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
- Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
- Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
- Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
- Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. . Proteomic Profiling. , 179-209 (2015).
- Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
- Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
- Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
- Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
- Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
- Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
- Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2011).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
- Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
- Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
- Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
- Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
- Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).
