Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Summary

La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L’elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l’espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all’invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

Abstract

I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l’integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c’è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.

DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l’espressione proteica all’interno di regioni spaziali specificate dall’utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l’espressione differenziale di più proteine all’interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un’analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all’interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all’interno delle quali quantificare l’espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all’interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.

Introduction

I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l’invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca¹, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva². L’invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesenchimale, in cui le cellule di glioma acquisiscono proprietà mesenchimali riducendo l’espressione di geni codificanti proteine della matrice extracellulare e molecole di adesione cellulare, amplificando la migrazione e facilitando la propagazione attraverso il microambiente tumorale ^3,4,5.

A livello molecolare, è stata dimostrata la rottura di diverse proteine che conferiscono stabilità cellulare e interfaccia con componenti immunogenici⁶. È noto che i gliomi infiltrativi subiscono la soppressione di proteine con proprietà anti-apoptotiche (ad esempio, PTEN)⁷. Inoltre sovraesprimono proteine che promuovono l’evasione della risposta immunitaria dell’ospite (ad esempio, PD1 / PDL1)⁸. La disregolazione di queste vie complesse aumenta la tumorigenicità e aumenta il potenziale maligno.

All’interno di campioni di glioma invasivo, l’obiettivo era quello di valutare l’espressione differenziale di proteine chiave per la crescita, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare e per l’integrità strutturale del microambiente tra componenti invasive e non invasive. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la regolazione differenziale delle proteine con un ruolo immunogenico attivo, offrendo informazioni sul meccanismo attraverso il quale le difese immunitarie dell’ospite compromesso possono aumentare il potenziale proliferativo e invasivo dei gliomi. Ciò è particolarmente rilevante data la recente ampiezza della ricerca che dimostra come i marcatori immunitari e i driver della disregolazione nella malignità possano servire come bersagli dell’immunoterapia. L’identificazione di bersagli terapeutici praticabili tra le molte proteine coinvolte nell’immunosorveglianza e nella reattività richiede un approccio altamente sensibile e completo.

Data l’ampia gamma di proteine candidate che possono essere studiate, abbiamo cercato un metodo simile all’immunoistochimica ma con una maggiore efficienza di elaborazione dei dati. Nel campo della biologia del cancro, DSP è emersa come una potente tecnologia con importanti vantaggi rispetto agli strumenti alternativi per l’analisi proteomica e la quantificazione. Il segno distintivo del DSP è la sua capacità di multiplexing ad alto rendimento, che consente lo studio simultaneo di diverse proteine all’interno di un campione, segnando un’importante distinzione dalle tecnologie standard ma a basso plex come l’immunoistochimica (IHC)^9,10. La caratteristica multiplex del DSP non ne compromette la fedeltà come strumento quantitativo e analitico, come dimostrato da studi che confrontano DSP e IHC. Quando viene utilizzato per la quantificazione proteomica di campioni di carcinoma polmonare non a piccole cellule, ad esempio, DSP ha dimostrato di avere risultati simili a IHC¹¹. Inoltre, DSP offre specifiche regionali personalizzabili, in cui gli utenti possono definire manualmente le regioni all’interno delle quali eseguire l’analisi proteomica. Ciò presenta un vantaggio rispetto ai metodi multiplex a sezione intera^10,12. In un unico ciclo di elaborazione, DSP offre quindi più livelli di analisi esaminando diversi bersagli proteici in più regioni di interesse.

DSP ha applicazioni in diversi contesti patologici. La DSP è particolarmente vantaggiosa nell’analisi oncologica, poiché la variazione spaziale può essere correlata alla trasformazione cellulare e all’espressione differenziale delle proteine. Ad esempio, DSP è stato utilizzato per confrontare il profilo proteomico del cancro al seno con il microambiente tumorale adiacente. Ciò comporta importanti implicazioni per la comprensione della storia naturale di questo tumore e della sua progressione, nonché della potenziale risposta al trattamento¹³. Ulteriori contesti che illustrano la versatilità della DSP includono la quantificazione spaziale della diversità proteica nel carcinoma prostatico¹⁴, l’associazione dell’espressione dei marcatori delle cellule immunitarie con la progressione della malattia nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo 15 e la dimostrazione di un gradiente epiteliale-mesenchimale dell’espressione proteica che distingue il carcinoma ovarico metastatico da quello primario a cellule chiare¹⁶ . Implementando la DSP, caratterizziamo la topografia spaziale delle proteine che potrebbero influenzare la tumorigenesi e l’invasione dei gliomi.

Protocol

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni di tessuto sono stati inclusi in questo studio. Vedere la sezione Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione della diapositiva17 Re…

Representative Results

La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento DSP eseguito su campioni di glioblastoma. Viene presentata una mappa di calore, che illustra uno dei metodi con cui acquisire visivamente i dati utilizzando il software DSP. Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Una gamma di colori dal blu al rosso denota rispettivamente un’espressione da bassa ad alta. La variabilità del colore all’interno di una riga riflette l’eter…

Discussion

Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l’aggressività dei gliomi e l’idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l’espressione differenziale¹⁸, incorporare la profilazione spaziale nell’approccio di quantificazione delle proteine consente un’analisi più efficace.

…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block