Digital romlig profilering for karakterisering av mikromiljøet i voksen type diffust infiltrerende gliom

Summary

Proteomisk dysregulering spiller en viktig rolle i spredningen av diffust infiltrerende gliomer, men flere relevante proteiner forblir uidentifiserte. Digital romlig prosessering (DSP) tilbyr en effektiv, høy gjennomstrømningsmetode for å karakterisere differensialuttrykket av kandidatproteiner som kan bidra til invasjon og migrasjon av infiltrative gliomer.

Abstract

Diffust infiltrerende gliomer er forbundet med høy morbiditet og dødelighet på grunn av den infiltrative karakteren av tumorspredning. De er morfologisk komplekse svulster, med en høy grad av proteomisk variabilitet over både selve svulsten og dens heterogene mikromiljø. Det ondartede potensialet til disse svulstene forbedres av dysreguleringen av proteiner involvert i flere viktige veier, inkludert prosesser som opprettholder cellulær stabilitet og bevarer mikromiljøets strukturelle integritet. Selv om det har vært mange bulk- og encellede gliomanalyser, er det en relativ mangel på romlig stratifisering av disse proteomiske dataene. Å forstå forskjeller i romlig fordeling av tumorogene faktorer og immuncellepopulasjoner mellom den indre svulsten, invasiv kant og mikromiljø gir verdifull innsikt i mekanismene som ligger til grunn for tumorproliferasjon og forplantning. Digital romprofilering (DSP) representerer en kraftig teknologi som kan danne grunnlaget for disse viktige flerlagsanalysene.

DSP er en metode som effektivt kvantifiserer proteinuttrykk innenfor brukerspesifiserte romlige regioner i en vevsprøve. DSP er ideell for å studere differensialuttrykket av flere proteiner innenfor og på tvers av skilleregioner, noe som muliggjør flere nivåer av kvantitativ og kvalitativ analyse. DSP-protokollen er systematisk og brukervennlig, noe som muliggjør tilpasset romlig analyse av proteomiske data. I dette eksperimentet er vevsmikromatriser konstruert fra arkiverte glioblastomkjernebiopsier. Deretter velges et panel av antistoffer, rettet mot proteiner av interesse i prøven. Antistoffene, som er prekonjugert til UV-fotospaltbare DNA-oligonukleotider, inkuberes deretter med vevsprøven over natten. Under fluorescensmikroskopi visualisering av antistoffene, regioner av interesse (ROIs) innenfor hvilke å kvantifisere proteinuttrykk er definert med prøvene. UV-lys blir deretter rettet mot hver avkastning, og spalter DNA-oligonukleotidene. Oligonukleotidene mikroaspireres og telles innenfor hver avkastning, og kvantifiserer det tilsvarende proteinet på romlig basis.

Introduction

Diffust infiltrerende gliomer er den vanligste typen ondartet hjernesvulst hos voksne og er alltid dødelig. Tilbøyeligheten til gliomceller til å migrere mye i hjernen er en stor terapeutisk utfordring. Mekanismen som de sprer innebærer rettet migrasjon og ukontrollert invasjon. Invasive gliomceller har vist seg å utvise tropisme og migrasjon langs hvite substanskanaler¹, med nyere forskning som impliserer demyelinisering av disse kanalene som en aktiv, protumorigen funksjon². Invasjon er mediert av en epitel-til-mesenkymal overgang, hvor gliomceller oppnår mesenkymale egenskaper ved å redusere uttrykket av gener som koder for ekstracellulære matriksproteiner og celleadhesjonsmolekyler, forsterker migrasjon og letter forplantning gjennom tumormikromiljøet ^3,4,5.

På molekylært nivå er^{det påvist} forstyrrelse av flere proteiner som gir cellulær stabilitet og grensesnitt med immunogene komponenter. Infiltrative gliomer er kjent for å gjennomgå undertrykkelse av proteiner med anti-apoptotiske (f.eks. PTEN) egenskaper⁷. De overuttrykker også proteiner som fremmer unnvikelse av vertsimmunresponsen (f.eks. PD1 / PDL1)⁸. Dysreguleringen av disse komplekse banene forbedrer tumorigenitet og øker ondartet potensial.

Innenfor prøver av invasive gliomer var målet å evaluere differensialuttrykket av proteiner som er nøkkelen til cellevekst, overlevelse og spredning, og til mikromiljøets strukturelle integritet mellom invasive og ikke-invasive komponenter. I tillegg søkte vi å studere differensialreguleringen av proteiner med en aktiv immunogen rolle, og ga innsikt i mekanismen der kompromittert vertsimmunforsvar kan forbedre det proliferative og invasive potensialet til gliomer. Dette er spesielt relevant gitt den siste bredden av forskning som viser hvordan immunmarkører og drivere for dysregulering i malignitet kan tjene som mål for immunterapi. Å identifisere levedyktige terapeutiske mål blant de mange proteinene som er involvert i immunovervåkning og reaktivitet krever en svært sensitiv og omfattende tilnærming.

Gitt det brede utvalget av kandidatproteiner som kan studeres, søkte vi en metode som ligner på immunhistokjemi, men med forbedret databehandlingseffektivitet. Innen kreftbiologi har DSP dukket opp som en kraftig teknologi med viktige fordeler i forhold til alternative verktøy for proteomisk analyse og kvantifisering. Kjennetegnet ved DSP er dens høykapasitetsmultipleksingsevne, noe som muliggjør samtidig studier av flere forskjellige proteiner i en prøve, og markerer et viktig skille fra standard, men lavere plex-teknologier som immunhistokjemi (IHC) ^9,10. Multiplex-funksjonen til DSP kompromitterer ikke dens troskap som et kvantitativt og analytisk verktøy, som demonstrert av studier som sammenligner DSP med IHC. Når det brukes til proteomisk kvantifisering av ikke-småcellede lungekreftprøver, har DSP for eksempel vist seg å ha lignende resultater som IHC¹¹. I tillegg tilbyr DSP tilpassbar regional spesifikasjon, der brukere manuelt kan definere regioner innenfor hvilke de skal utføre proteomisk analyse. Dette gir en fordel i forhold til helseksjonsmultipleksmetoder^10,12. I en enkelt runde med behandling tilbyr DSP dermed flere lag med analyse ved å kartlegge flere proteinmål på tvers av flere interesseområder.

DSP har applikasjoner i flere forskjellige patologiske innstillinger. DSP er spesielt fordelaktig i onkologisk analyse, da romlig variasjon kan korrelere med cellulær transformasjon og differensial proteinuttrykk. For eksempel har DSP blitt brukt til å sammenligne den proteomiske profilen til brystkreft med det tilstøtende tumormikromiljøet. Dette har viktige implikasjoner for å forstå den naturlige historien til denne svulsten og dens progresjon, samt potensiell respons på behandling¹³. Ytterligere kontekster som illustrerer allsidigheten til DSP inkluderer romlig kvantifisering av proteindiversitet i prostatakreft¹⁴, assosiasjon av immuncellemarkøruttrykk med sykdomsprogresjon i hode- og nakkeplateepitelkarsinom 15, og demonstrasjon av en epitel-mesenkymal gradient av proteinuttrykk som skiller metastatisk fra primær klarcellet eggstokkreft¹⁶ . Ved å implementere DSP karakteriserer vi den romlige topografien til proteiner som kan påvirke tumorigenese og invasjon av gliomer.

Protocol

Protokollen som er skissert nedenfor følger retningslinjene til Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene som fikk vevsprøver inkludert i denne studien. Se delen Materialtabell for detaljer knyttet til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Lysbilde forberedelse17 Hent eller klargjør formalinfast, parafin-innebygd vev fr…

Representative Results

Figur 4 viser de representative resultatene fra et DSP-eksperiment utført på prøver av glioblastom. Et varmekart presenteres, som illustrerer en av metodene for å fange data visuelt ved hjelp av DSP-programvaren. Rader representerer proteinmål, og hver kolonne tilsvarer et område av interesse. Et fargeområde fra blått til rødt angir henholdsvis lavt til høyt uttrykk. Variabilitet av farge i en rad reflekterer regional protein heterogenitet og antyder en mulig romlig tilknytning til…

Discussion

Gitt mangfoldet av proteiner som potensielt kan påvirke aggressiviteten til gliomer og forestillingen om at flere av disse proteinene forblir uoppdaget, er en proteinkvantifiseringsmetode med høy gjennomstrømning en ideell teknologisk tilnærming. I tillegg, gitt at romlige data i onkologiske prøver ofte korrelerer med differensialuttrykk¹⁸, gir inkorporering av romlig profilering i proteinkvantifiseringsmetoden mer effektiv analyse.

Den høye gjennomstrømningsmeto…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block