Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Summary

Proteomische Dysregulation spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung diffus infiltrierender Gliome, aber mehrere relevante Proteine bleiben unidentifiziert. Digital Spatial Processing (DSP) bietet einen effizienten Hochdurchsatzansatz zur Charakterisierung der differentiellen Expression von Kandidatenproteinen, die zur Invasion und Migration infiltrativer Gliome beitragen können.

Abstract

Diffus infiltrierende Gliome sind aufgrund der infiltrativen Natur der Tumorausbreitung mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden. Sie sind morphologisch komplexe Tumoren mit einem hohen Grad an proteomischer Variabilität sowohl über den Tumor selbst als auch über seine heterogene Mikroumgebung. Das bösartige Potenzial dieser Tumoren wird durch die Dysregulation von Proteinen verstärkt, die an mehreren Schlüsselwegen beteiligt sind, einschließlich Prozessen, die die zelluläre Stabilität aufrechterhalten und die strukturelle Integrität der Mikroumgebung bewahren. Obwohl es zahlreiche Massen- und Einzelzell-Gliomanalysen gab, gibt es einen relativen Mangel an räumlicher Schichtung dieser proteomischen Daten. Das Verständnis der Unterschiede in der räumlichen Verteilung von tumorigenen Faktoren und Immunzellpopulationen zwischen dem intrinsischen Tumor, dem invasiven Rand und der Mikroumgebung bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die der Tumorproliferation und -ausbreitung zugrunde liegen. Digital Spatial Profiling (DSP) stellt eine leistungsstarke Technologie dar, die die Grundlage für diese wichtigen Mehrschichtanalysen bilden kann.

DSP ist eine Methode, die die Proteinexpression innerhalb benutzerdefinierter räumlicher Regionen in einer Gewebeprobe effizient quantifiziert. DSP ist ideal für die Untersuchung der differentiellen Expression mehrerer Proteine innerhalb und zwischen Regionen der Unterscheidung und ermöglicht mehrere Ebenen der quantitativen und qualitativen Analyse. Das DSP-Protokoll ist systematisch und benutzerfreundlich und ermöglicht eine maßgeschneiderte räumliche Analyse von Proteomdaten. In diesem Experiment werden Gewebe-Microarrays aus archivierten Glioblastom-Kernbiopsien konstruiert. Als nächstes wird ein Panel von Antikörpern ausgewählt, die auf Proteine von Interesse in der Probe abzielen. Die Antikörper, die an UV-photospaltbare DNA-Oligonukleotide vorkonjugiert werden, werden dann über Nacht mit der Gewebeprobe inkubiert. Unter fluoreszenzmikroskopischer Visualisierung der Antikörper werden mit den Proben Interessengebiete (ROIs) definiert, innerhalb derer die Proteinexpression quantifiziert werden kann. UV-Licht wird dann auf jeden ROI gerichtet und spaltet die DNA-Oligonukleotide. Die Oligonukleotide werden mikroaspiriert und innerhalb jedes ROI gezählt, wobei das entsprechende Protein auf räumlicher Basis quantifiziert wird.

Introduction

Diffus infiltrierende Gliome sind die häufigste Form von bösartigen Hirntumoren bei Erwachsenen und sind ausnahmslos tödlich. Die Neigung von Gliomzellen, extensiv im Gehirn zu wandern, ist eine große therapeutische Herausforderung. Der Mechanismus, durch den sie sich ausbreiten, beinhaltet gezielte Migration und unkontrollierte Invasion. Es wurde gezeigt, dass invasive Gliomzellen Tropismus und Migration entlang der Bahnen der weißen Substanz aufweisen¹, wobei neuere Forschungen die Demyelinisierung dieser Trakte als aktives, protumorigenes Merkmal implizieren². Die Invasion wird durch einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang vermittelt, bei dem Gliomzellen mesenchymale Eigenschaften erwerben, indem sie die Expression von Genen reduzieren, die extrazelluläre Matrixproteine und Zelladhäsionsmoleküle kodieren, die Migration verstärken und die Ausbreitung durch die Tumormikroumgebung ^{erleichtern 3,4,5}.

Auf molekularer Ebene wurde die Störung mehrerer Proteine nachgewiesen, die zelluläre Stabilität verleihen und mit immunogenen Komponenten interagieren⁶. Es ist bekannt, dass infiltrative Gliome eine Unterdrückung von Proteinen mit anti-apoptotischen (z. B. PTEN) Eigenschaften durchlaufen⁷. Sie überexprimieren auch Proteine, die die Umgehung der Immunantwort des Wirts fördern (z. B. PD1 / PDL1)⁸. Die Fehlregulation dieser komplexen Signalwege erhöht die Tumorigenität und erhöht das maligne Potenzial.

Innerhalb von Proben invasiver Gliome bestand das Ziel darin, die differentielle Expression von Proteinen zu bewerten, die für das Wachstum, Überleben und die Proliferation von Zellen sowie für die strukturelle Integrität der Mikroumgebung zwischen invasiven und nicht-invasiven Komponenten entscheidend sind. Darüber hinaus versuchten wir, die differentielle Regulation von Proteinen mit einer aktiven immunogenen Rolle zu untersuchen und Einblicke in den Mechanismus zu geben, durch den kompromittierte Immunabwehr des Wirts das proliferative und invasive Potenzial von Gliomen verbessern kann. Dies ist besonders relevant angesichts der jüngsten Breite der Forschung, die zeigt, wie Immunmarker und Treiber von Dysregulation bei Malignität als Ziele der Immuntherapie dienen können. Die Identifizierung praktikabler therapeutischer Ziele unter den vielen Proteinen, die an der Immunüberwachung und Reaktivität beteiligt sind, erfordert einen hochsensiblen und umfassenden Ansatz.

Angesichts der breiten Palette von Kandidatenproteinen, die untersucht werden können, suchten wir nach einer Methode, die der Immunhistochemie ähnelt, aber mit verbesserter Datenverarbeitungseffizienz. Im Bereich der Krebsbiologie hat sich DSP zu einer leistungsstarken Technologie mit wichtigen Vorteilen gegenüber alternativen Werkzeugen für die Proteomanalyse und -quantifizierung entwickelt. Das Markenzeichen von DSP ist seine Hochdurchsatz-Multiplexing-Fähigkeit, die die gleichzeitige Untersuchung mehrerer verschiedener Proteine innerhalb einer Probe ermöglicht, was einen wichtigen Unterschied zu Standard-, aber Low-Plex-Technologien wie der Immunhistochemie (IHC) ^{darstellt9,10}. Die Multiplex-Funktion von DSP beeinträchtigt nicht seine Treue als quantitatives und analytisches Werkzeug, wie Studien zeigen, in denen DSP mit IHC verglichen wird. Bei der Verwendung zur proteomischen Quantifizierung von nicht-kleinzelligen Lungenkrebsproben hat DSP beispielsweise ähnliche Ergebnisse wie IHC¹¹. Darüber hinaus bietet DSP eine anpassbare regionale Spezifikation, in der Benutzer manuell Regionen definieren können, in denen proteomische Analysen durchgeführt werden sollen. Dies stellt einen Vorteil gegenüber Ganzsektions-Multiplex-Methoden^10,12 dar. In einer einzigen Verarbeitungsrunde bietet DSP somit mehrere Analyseebenen, indem mehrere Proteinziele in mehreren Regionen von Interesse untersucht werden.

DSP hat Anwendungen in verschiedenen pathologischen Einstellungen. DSP ist besonders vorteilhaft in der onkologischen Analyse, da räumliche Variation mit zellulärer Transformation und differentieller Proteinexpression korrelieren kann. Zum Beispiel wurde DSP verwendet, um das proteomische Profil von Brustkrebs mit der benachbarten Tumormikroumgebung zu vergleichen. Dies hat wichtige Implikationen für das Verständnis des natürlichen Verlaufs dieses Tumors und seines Fortschreitens sowie für ein mögliches Ansprechen auf die Behandlung¹³. Weitere Kontexte, die die Vielseitigkeit der DSP veranschaulichen, umfassen die räumliche Quantifizierung der Proteindiversität bei Prostatakrebs¹⁴, die Assoziation der Immunzellmarkerexpression mit der Krankheitsprogression beim Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom 15 und die Demonstration eines epithelial-mesenchymalen Gradienten der Proteinexpression, der metastasierten von primärem klarzelligem Ovarialkarzinom unterscheidet¹⁶ . Durch die Implementierung von DSP charakterisieren wir die räumliche Topographie von Proteinen, die die Tumorgenese und Invasion von Gliomen beeinflussen könnten.

Protocol

Das unten beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien des Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Die Einwilligungserklärung wurde von den Patienten eingeholt, deren Gewebeproben in diese Studie eingeschlossen wurden. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie im Abschnitt Materialtabelle . 1. Objektträgervorbereitung17 Gew…

Representative Results

Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Ergebnisse eines DSP-Experiments, das an Proben von Glioblastomen durchgeführt wurde. Es wird eine Heatmap vorgestellt, die eine der Methoden zur visuellen Erfassung von Daten mit der DSP-Software veranschaulicht. Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Ein Farbbereich von Blau bis Rot bedeutet einen niedrigen bzw. hohen Ausdruck. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Pr…

Discussion

Angesichts der Vielfalt der Proteine, die möglicherweise die Aggressivität von Gliomen beeinflussen könnten, und der Vorstellung, dass mehrere dieser Proteine unentdeckt bleiben, ist eine Hochdurchsatz-Proteinquantifizierungsmethode ein idealer technologischer Ansatz. Da räumliche Daten in onkologischen Proben häufig mit der differentiellen Expression^{korrelieren 18}, ermöglicht die Einbeziehung räumlicher Profile in den Proteinquantifizierungsansatz eine effektivere Analyse.

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Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block