Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Summary

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Abstract

Gliomas de infiltração difusa estão associados a alta morbidade e mortalidade devido à natureza infiltrativa da disseminação tumoral. São tumores morfologicamente complexos, com alto grau de variabilidade proteômica tanto no próprio tumor quanto em seu microambiente heterogêneo. O potencial maligno desses tumores é reforçado pela desregulação de proteínas envolvidas em várias vias-chave, incluindo processos que mantêm a estabilidade celular e preservam a integridade estrutural do microambiente. Embora tenha havido numerosas análises de glioma a granel e unicelular, há uma relativa escassez de estratificação espacial desses dados proteômicos. A compreensão das diferenças na distribuição espacial de fatores tumorigênicos e populações de células imunes entre o tumor intrínseco, a borda invasiva e o microambiente oferece informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes à proliferação e propagação do tumor. O perfil espacial digital (DSP) representa uma tecnologia poderosa que pode formar a base para essas importantes análises multicamadas.

O DSP é um método que quantifica eficientemente a expressão de proteínas dentro de regiões espaciais especificadas pelo usuário em uma amostra de tecido. O DSP é ideal para estudar a expressão diferencial de múltiplas proteínas dentro e entre regiões de distinção, permitindo múltiplos níveis de análise quantitativa e qualitativa. O protocolo DSP é sistemático e fácil de usar, permitindo a análise espacial personalizada de dados proteômicos. Neste experimento, microarranjos teciduais são construídos a partir de biópsias de núcleo de glioblastoma arquivadas. Em seguida, um painel de anticorpos é selecionado, visando proteínas de interesse dentro da amostra. Os anticorpos, que são pré-conjugados a oligonucleotídeos de DNA UV-fotoclevíveis, são então incubados com a amostra de tecido durante a noite. Sob a visualização por microscopia de fluorescência dos anticorpos, as regiões de interesse (ROIs) dentro das quais quantificar a expressão proteica são definidas com as amostras. A luz UV é então direcionada para cada ROI, clivando os oligonucleotídeos do DNA. Os oligonucleotídeos são microaspirados e contados dentro de cada ROI, quantificando a proteína correspondente em uma base espacial.

Introduction

Gliomas de infiltração difusa são o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos e são invariavelmente letais. A propensão para as células do glioma migrarem extensivamente no cérebro é um grande desafio terapêutico. O mecanismo pelo qual eles se espalham envolve migração dirigida e invasão descontrolada. Demonstrou-se que as células invasivas do glioma exibem tropismo e migração ao longo dos tratos da substância branca¹, com pesquisas recentes implicando a desmielinização desses tratos como uma característica ativa e protumorigênica². A invasão é mediada por uma transição epitelial-mesenquimal, na qual as células do glioma adquirem propriedades mesenquimais, reduzindo a expressão de genes que codificam proteínas da matriz extracelular e moléculas de adesão celular, amplificando a migração e facilitando a propagação através do microambiente tumoral ^3,4,5.

No nível molecular, tem sido demonstrada a ruptura de diversas proteínas que conferem estabilidade celular e interface com componentes imunogênicos⁶. Sabe-se que os gliomas infiltrativos sofrem supressão de proteínas com propriedades antiapoptóticas (por exemplo, PTEN)⁷. Eles também superexpressam proteínas que promovem a evasão da resposta imune do hospedeiro (por exemplo, PD1/PDL1)⁸. A desregulação dessas vias complexas aumenta a tumorigenicidade e aumenta o potencial maligno.

Dentro de amostras de glioma invasivo, o objetivo foi avaliar a expressão diferencial de proteínas fundamentais para o crescimento, sobrevivência e proliferação celular, e para a integridade estrutural do microambiente entre componentes invasivos e não invasivos. Além disso, procuramos estudar a regulação diferencial de proteínas com um papel imunogênico ativo, oferecendo informações sobre o mecanismo pelo qual as defesas imunológicas comprometidas do hospedeiro podem aumentar o potencial proliferativo e invasivo dos gliomas. Isso é especialmente relevante, dada a recente amplitude de pesquisas que demonstram como os marcadores imunológicos e os fatores de desregulação na malignidade podem servir como alvos da imunoterapia. A identificação de alvos terapêuticos viáveis entre as muitas proteínas envolvidas na imunovigilância e reatividade requer uma abordagem altamente sensível e abrangente.

Dada a ampla gama de proteínas candidatas que podem ser estudadas, buscamos um método semelhante à imuno-histoquímica, mas com maior eficiência no processamento de dados. Dentro do campo da biologia do câncer, o DSP emergiu como uma tecnologia poderosa com vantagens importantes sobre ferramentas alternativas para análise e quantificação proteômica. A marca registrada do DSP é sua capacidade de multiplexação de alto rendimento, permitindo o estudo simultâneo de várias proteínas diferentes dentro de uma amostra, marcando uma distinção importante das tecnologias padrão, mas de baixo plexo, como a imuno-histoquímica (IHC)^9,10. A característica multiplex do DSP não compromete sua fidelidade como ferramenta quantitativa e analítica, como demonstrado por estudos comparando DSP com IHC. Quando usado para quantificação proteômica de espécimes de câncer de pulmão de células não pequenas, por exemplo, o DSP demonstrou ter resultados semelhantes aos da IHC¹¹. Além disso, o DSP oferece especificação regional personalizável, na qual os usuários podem definir manualmente as regiões dentro das quais executar a análise proteômica. Isso apresenta uma vantagem sobre os métodos multiplex de seção inteira^10,12. Em uma única rodada de processamento, o DSP oferece várias camadas de análise, pesquisando vários alvos de proteínas em várias regiões de interesse.

DSP tem aplicações em vários contextos patológicos diferentes. A DSP é especialmente vantajosa na análise oncológica, pois a variação espacial pode se correlacionar com a transformação celular e a expressão diferencial de proteínas. Por exemplo, o DSP tem sido usado para comparar o perfil proteômico do câncer de mama com o microambiente tumoral adjacente. Isso traz implicações importantes para a compreensão da história natural desse tumor e sua progressão, bem como para a potencial resposta ao tratamento¹³. Contextos adicionais que ilustram a versatilidade do DSP incluem quantificação espacial da diversidade proteica no câncer de próstata¹⁴, associação da expressão de marcadores de células imunes com a progressão da doença no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço 15 e demonstração de um gradiente epitelial-mesenquimal de expressão proteica distinguindo o câncer de ovário metastático de células claras primário¹⁶ . Ao implementar o DSP, caracterizamos a topografia espacial de proteínas que poderiam impactar a tumorigênese e a invasão de gliomas.

Protocol

O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de Dartmouth-Hitchcock. O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras de tecido foram incluídas neste estudo. Consulte a seção Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo. 1. Preparação de slides17 Recupere ou prepar…

Representative Results

A Figura 4 mostra os resultados representativos de um experimento de DSP realizado em amostras de glioblastoma. Um mapa de calor é apresentado, ilustrando um dos métodos pelos quais capturar dados visualmente usando o software DSP. As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. Um intervalo de cores de azul a vermelho denota expressão baixa a alta, respectivamente. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteín…

Discussion

Dada a diversidade de proteínas que poderiam potencialmente influenciar a agressividade dos gliomas e a noção de que várias dessas proteínas permanecem desconhecidas, um método de quantificação de proteínas de alto rendimento é uma abordagem tecnológica ideal. Além disso, dado que os dados espaciais em amostras oncológicas muitas vezes se correlacionam com a expressão diferencial¹⁸, a incorporação do perfil espacial na abordagem de quantificação de proteínas permite uma análise…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block