Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode
Summary
Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.
Abstract
Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufklärung des Immunsystems. Diese Beziehung ist äußerst wichtig für das Verständnis von Autoimmunerkrankungen, die nicht nur durch genetische Faktoren angetrieben werden, sondern auch durch Umweltfaktoren, die den Ausbruch auslösen und/oder den Krankheitsverlauf verschlimmern können. Eine zuvor veröffentlichte Studie über die Dynamik der Darmmikrobiota bei lupusanfälligen MRL / lpr-weiblichen Mäusen zeigte, wie Veränderungen der Darmmikrobiota das Fortschreiten der Krankheit verändern können. Hier wird ein Protokoll zur Extraktion repräsentativer Proben aus der Darmmikrobiota für Studien der Autoimmunität beschrieben. Mikrobiota-Proben werden aus dem Anus entnommen und verarbeitet, aus denen die DNA mit einem Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert und durch Alkoholfällung gereinigt wird. Nach der PCR werden gereinigte Amplicons mit einer Next Generation Sequencing-Plattform am Argonne National Laboratory sequenziert. Schließlich werden die 16S ribosomalen RNA-Gensequenzierungsdaten analysiert. Als Beispiel werden Daten aus Darmmikrobiota-Vergleichen von MRL/lpr-Mäusen mit oder ohne CX3CR1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in Gattungen, die pathogene Bakterien enthalten, wie die im Stamm Proteobacteria sowie in der Gattung Bifidobacterium, die als Teil der gesunden kommensalen Mikrobiota gilt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese einfache, kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zuverlässig ist und bei der Untersuchung von Darmmikrobiota-Veränderungen im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen helfen kann.
Introduction
Mensch und Bakterien existieren schon lange nebeneinander. Sie haben eine co-abhängige Beziehung mit gegenseitig vorteilhaften Effekten aufgebaut, die die Immunantwort des Wirts quantitativ und qualitativ beeinflusst1. Neuere Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hin, zu denen Multiple Sklerose 2, rheumatoide Arthritis3,Typ-2-Diabetes 4, entzündliche Darmerkrankungen5 und systemischer Lupus erythematodes (SLE) gehören6. Ob die Darmmikrobiota jedoch die Hauptursache oder eine Nebenwirkung dieser Autoimmunerkrankungen ist, ist noch unklar7. Möglicherweise könnte die Darmmikrobiota die Krankheit während der Effektorphase von Autoimmunerkrankungen verschlimmern oder eine Rolle bei der Regulierung der Induktion dieser Krankheiten spielen8.
Intestinale Dysbiose wurde bei weiblichen Lupus-anfälligen MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) Mäusen berichtet, und Darmmikrobiota-Veränderungen mit einer signifikanten Erschöpfung von Laktobazillen wurden beobachtet9. Wenn eine Mischung aus fünf Lactobacillus-Stämmen oral verabreicht wurde, wurden die lupusähnlichen Symptome bei diesen Mäusen weitgehend abgeschwächt, was auf eine wesentliche Rolle der Mikrobiota bei der Regulierung der SLE-Pathogenese hindeutet.
Die folgende Technik der DNA-Extraktion ermöglicht es, Mikrobiota-Fluktuationen zu verfolgen und sie qualitativ und quantitativ im Verlauf der murinen SLE-ähnlichen Erkrankung bei zu Lupus neigenden Mäusen zu analysieren. Unabhängig davon, ob die gesunde Darmmikrobiota untersucht oder Dysbiose definiert werden soll, ist es wichtig, kritisch zu untersuchen, wie Daten gesammelt werden und ob sie genau und reproduzierbar sind10. Jeder Schritt ist in diesem Prozess entscheidend. Eine geeignete Methodik muss verwendet werden, um mikrobielle DNA zu extrahieren, da jedes mögliche Problem, das Verzerrungen während des DNA-Extraktionsprozesses einführt, zu einer ungenauen mikrobiellen Repräsentation führen könnte. Während die Phenol-Chloroform-Methode hier beschrieben wird, gibt es kommerziell erhältliche Kits zur Extraktion von DNA aus Bakterien, die in bestimmten Fällen gut funktionieren11. Ihre Verwendbarkeit ist jedoch durch die Kosten und die erforderliche Probenmenge begrenzt.
Das hier vorgestellte Protokoll ist kostengünstig und erfordert nur eine geringe Probenmenge. Es funktioniert gut mit jeder Art von Stuhlprobe und ist nützlich bei der Untersuchung der Dynamik der Darmmikrobiota im Laufe der Zeit sowie bei Vergleichen zwischen Gruppen. DNA wird mit einer Methode der Alkoholreinigung isoliert, die Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol verwendet. Die alkoholbasierte Extraktion hilft, die Probe von Proteinen und Lipiden zu reinigen und zu entfernen, wo im letzten Schritt DNA ausgefällt wird. Die vorgeschlagene Methode hat eine signifikant hohe Effizienz und Qualität und hat sich bei der Identifizierung von Bakterienpopulationen als genau erwiesen. Ein kritischer Hinweis während des Verfahrens ist, dass DNA-Kontaminationen auftreten können und daher eine angemessene Probenhandhabung erforderlich ist12.
Die DNA wird dann von den Next Generation Sequencing-Plattformen auf das 16S rRNA-Gen, wie das Illumina MiSeq, analysiert. Insbesondere wird die hypervariable Region V4 analysiert, um eine bessere Quantifizierung für hochrangige Taxa13 zu ermöglichen. Die anschließende bioinformatische Analyse wird ausgelagert, gefolgt von einer Inhouse-Analyse mit statistischen Standardmethoden. Es gibt zahlreiche Open-Source-Bioinformatik-Softwareprogramme für die nachgelagerte Sequenzierung, und die Art der durchgeführten Analysen hängt stark von der spezifischen biologischen Fragestellung von Interesseab 14. Dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf die experimentellen Schritte vor der Sequenzierung und bietet eine vielseitigere, kostengünstigere, vergleichbare und effizientere Methode zur Gewinnung von DNA aus Stuhlproben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine ausgewogene Darmmikrobiota kann den menschlichen Körper vor Krankheiten schützen. Sobald dieses Gleichgewicht durch externe oder interne Auslöser gestört wird, können die Folgen verheerend sein. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Dynamik der Darmmikrobiota in Mausmodellen zu analysieren. Die Methode eignet sich nicht nur für Vergleiche zwischen Gruppen, sondern auch für die Verfolgung der Darmmikrobiota im Zeitverlauf, um zeitabhängige Faktoren, die die Darmmikrobiota stören, besser zu identifizier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen die Hilfe des Argonne National Laboratory und unserer kooperierenden Bioinformatiker. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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