Analyse av fekal mikrobiotadynamikk i lupusutsatte mus ved hjelp av en enkel, kostnadseffektiv DNA-isolasjonsmetode
Summary
Denne protokollen gir en enkel, kostnadseffektiv DNA-isolasjonsmetode for analyse av murine gut mikrobiota endringer under utvikling av autoimmun sykdom.
Abstract
Tarmmikrobiota har en viktig rolle i å utdanne immunforsvaret. Denne sammenhengen er ekstremt viktig for å forstå autoimmune sykdommer som ikke bare er drevet av genetiske faktorer, men også miljøfaktorer som kan utløse utbruddet og/eller forverre sykdomsforløpet. En tidligere publisert studie om dynamikken i tarmmikrobiotaen hos lupus-utsatt MRL / lpr kvinnelige mus viste hvordan endringer i tarmmikrobiotaen kan endre sykdomsprogresjonen. Her beskrives en protokoll for å trekke ut representative prøver fra tarmmikrobiotaen for studier av autoimmunitet. Mikrobiotaprøver samles fra anus og behandles, hvorfra DNA ekstraheres ved hjelp av en fenol-kloroformmetode og renses ved alkoholutfelling. Etter at PCR er utført, sekvenseres rensede amplikoner ved hjelp av en Next Generation Sequencing-plattform ved Argonne National Laboratory. Til slutt analyseres 16S ribosomale RNA-gensekvenseringsdata. Som et eksempel er data hentet fra tarmmikrobiota-sammenligninger av MRL / lpr-mus med eller uten CX3CR1 vist. Resultatene viste signifikante forskjeller i slekter som inneholder patogene bakterier som de i phylum Proteobacteria, samt slekten Bifidobacterium, som regnes som en del av den sunne kommensale mikrobiotaen. Oppsummert er denne enkle, kostnadseffektive DNA-isolasjonsmetoden pålitelig og kan hjelpe undersøkelsen av tarmmikrobiotaendringer assosiert med autoimmune sykdommer.
Introduction
Mennesker og bakterier har eksistert sammen i lang tid. De har etablert et medavhengig forhold med gjensidige gunstige effekter som påvirker vertsimmunresponser på kvantitative og kvalitative måter1. Nylige studier tyder på en sammenheng mellom tarmmikrobiotasammensetningen og patogenesen av autoimmune sykdommer som inkluderer multippel sklerose 2, revmatoid artritt3, type2 diabetes4, inflammatorisk tarmsykdom5 og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Men om tarmmikrobiotaen er hovedårsaken eller en sekundær effekt av disse autoimmune sykdommene, er det fortsatt uklart7. Potensielt kan tarmmikrobiota forverre sykdommen under effektorfasen av autoimmune lidelser eller spille en rolle i å regulere induksjonen av disse sykdommene8.
Intestinal dysbiose er rapportert hos kvinnelige lupus-utsatte MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) mus, og tarmmikrobiotaendringer med signifikant uttømming av laktobaciller ble observert9. Når en blanding av fem Lactobacillus-stammer ble oralt administrert, ble lupus-lignende symptomer i stor grad dempet i disse musene, noe som tyder på en viktig rolle for mikrobiota i regulering av SLE-patogenese.
Følgende teknikk for DNA-ekstraksjon gjør det mulig å følge mikrobiotafluktuasjoner og analysere dem kvalitativt og kvantitativt i løpet av murine SLE-lignende sykdom hos lupus-utsatte mus. Enten du skal undersøke den sunne tarmmikrobiotaen eller definere dysbiose, er det viktig å kritisk undersøke hvordan data samles inn og om det er nøyaktig og reproduserbart10. Hvert trinn er kritisk i denne prosessen. En passende metode må brukes til å trekke ut mikrobielt DNA, da ethvert mulig problem som introduserer forstyrrelser under DNA-ekstraksjonsprosessen kan føre til unøyaktig mikrobiell representasjon. Mens fenol-kloroformmetoden er beskrevet her, er det kommersielt tilgjengelige sett for å trekke ut DNA fra bakterier som fungerer bra i spesielle tilfeller11. Imidlertid er deres brukervennlighet begrenset av kostnaden og nødvendig prøvemengde.
Protokollen som presenteres her er kostnadseffektiv og krever bare en liten mengde prøve. Det fungerer fint med alle slags avføringsprøver og er nyttig for å studere dynamikken i tarmmikrobiotaen over tid, samt sammenligninger mellom grupper. DNA isoleres med en metode for alkoholrensing, som bruker fenol, kloroform og isoamylalkohol. Alkoholbasert ekstraksjon bidrar til å rense og fjerne prøven av proteiner og lipider, hvor DNA utfelles i det siste trinnet. Den foreslåtte metoden har betydelig høy effektivitet og kvalitet og har vist seg å være nøyaktig i å identifisere bakteriepopulasjoner. Et kritisk notat under prosedyren er at DNA-forurensning kan oppstå, og dermed er det nødvendig med passende prøvehåndtering12.
DNA blir deretter analysert av Next Generation Sequencing-plattformene for 16S rRNA-genet, for eksempel Illumina MiSeq. Spesielt analyseres V4 hypervariabel region for å gi en bedre kvantifisering for høyrangs taxa13. Den påfølgende bioinformatikkanalysen er outsourcet, etterfulgt av intern analyse ved hjelp av standard statistiske metoder. Det finnes mange open-source bioinformatikk programmer tilgjengelig for nedstrøms sekvensering, og den type analyser som utføres avhenger sterkt av det spesifikke biologiske spørsmålet av interesse14. Denne protokollen fokuserer spesielt på de eksperimentelle trinnene før sekvensering og gir en mer allsidig, kostnadseffektiv, sammenlignbar og effektiv metode for å oppnå DNA fra fekale prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Balansert tarmmikrobiota kan beskytte menneskekroppen mot sykdommer. Når denne balansen er forstyrret av eksterne eller interne utløsere, kan konsekvensene være ødeleggende. Denne metoden presenterer en måte å analysere dynamikken i tarmmikrobiota i murine modeller. Metoden er egnet ikke bare for sammenligninger mellom grupper, men også for å spore tarmmikrobiotaen over tid for bedre å identifisere tidsavhengige faktorer som forstyrrer tarmmikrobiotaen.
Alle musene i forsøket må hå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi setter pris på hjelpen fra Argonne National Laboratory og våre samarbeidende bioinformatikere. Dette arbeidet støttes av ulike NIH og interne tilskudd.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
