使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性
Summary
本文描述了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成协议，以测量细胞的流变特性。该方案在研究不同生理病理条件下红细胞的粘弹性特性方面具有广泛的适用性。
Abstract
红细胞的粘弹性性已经通过一系列技术进行了研究。但是，报告的实验数据各不相同。这不仅归因于细胞的正常变异性，还归因于细胞反应方法和模型的差异。在这里，采用使用光学镊子和散焦显微镜的集成协议来获得频率范围为1 Hz至35 Hz的红细胞流变特征。虽然光学镊子用于测量红细胞复合弹性常数，但散焦显微镜能够获得细胞高度分布、体积及其形状因子的参数，该参数允许将复杂的弹性常数转换为复杂的剪切模量。此外，应用软玻璃流变学模型，可以获得两种模量的缩放指数。开发的方法允许探索红细胞的机械行为，表征其粘弹性参数，在明确定义的实验条件下获得，用于几种生理和病理条件。
Introduction
成熟的红细胞（RBC），也称为红细胞，在通过人体最窄的毛细血管时能够延长其大小的两倍以上1。这种能力归因于它们在承受外部载荷时独特的变形能力。
近年来，不同的研究在红细胞表面表征了这一特征2，3。描述材料在外部载荷下的弹性和粘性响应的物理领域称为流变学。通常，当施加外力时，产生的变形取决于材料的性质，可分为存储能量的弹性变形或耗散能量的粘性变形4。所有细胞，包括红细胞，都表现出粘弹性行为;换句话说，能量既被储存又被耗散。因此，电池的粘弹性响应可以通过其复剪切模量 G*（ω） = G’（ω） + iG“（ω） 来表征，其中 G‘ （ω） 是与其弹性行为相关的存储模量，G”（ω） 是与其粘度相关的损耗模量4.此外，现象学模型已被用于描述细胞响应，其中最常用的一种称为软玻璃流变模型5，其特征在于复剪切模量随负载频率的幂律依赖性。
基于单细胞的方法已被采用来表征红细胞的粘弹性，通过施加力和测量位移作为施加载荷的函数2，3。然而，对于复杂的剪切模量，在文献中找不到的结果很少。使用动态光散射，报告的RBC存储和损耗模量值在0.01-1 Pa之间变化，频率范围为1-100 Hz6。通过使用光学磁扭曲细胞术，获得了明显的复合弹性模量7，并且为了比较目的，声称乘法因子可能澄清差异。
最近，建立了一种基于光学镊子（OT）和散焦显微镜（DM）的新方法，作为定量绘制人红细胞在时间依赖性负荷下的剪切模量的存储和损失的集成工具8，9。此外，使用软玻璃流变模型来拟合结果并获得表征红细胞8，9的幂律系数。
总体而言，开发的方法8，9（其协议将在下面详细描述）通过使用形状因子F f的测量值来阐明以前的差异，该测量值将力和变形与RBC表面的应力和应变相关联，并且可以用作一种新的诊断方法，能够定量确定从具有不同血液的个体获得的红细胞的粘弹性参数和软玻璃状特征病症。使用下面描述的方案进行这种表征，可能会为从机械生物学角度理解红细胞的行为开辟新的可能性。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中，提出了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成方法，以定量映射RBC的粘弹性。 确定存储和损失剪切模量的结果，以及表征RBC软玻璃流变学的缩放指数。该协议应用于不同的实验条件，例如在生理情况8 或沿着 恶性疟原虫 红细胞内循环9 的每个阶段已经进行。
文献中的参考文献指出了红细胞流变学的差异，部分归因于在?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢CENABIO高级显微镜设施的所有成员提供的所有重要帮助。这项工作得到了巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）、高级财政编码001、里约热内卢国家宪法权利保护令基金会（FAPERJ）和圣保罗国家宪法权利保护基金会（FAPESP）的支持。B.P.得到了FAPERJ的JCNE资助。
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
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