ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाल रक्त कोशिकाओं के विस्कोस्टिक गुणों का मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
यहां, कोशिकाओं के रियोलॉजिकल गुणों को मापने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में परिवर्तनीय फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत एरिथ्रोसाइट्स के विस्कोस्टिक गुणों का अध्ययन करने में व्यापक प्रयोज्यता है।
Abstract
एरिथ्रोसाइट्स के विस्कोस्टिक गुणों की जांच कई तकनीकों द्वारा की गई है। हालांकि, रिपोर्ट किए गए प्रयोगात्मक डेटा अलग-अलग हैं। यह न केवल कोशिकाओं की सामान्य परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार है, बल्कि सेल प्रतिक्रिया के तरीकों और मॉडल में अंतर के लिए भी जिम्मेदार है। यहां, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक एकीकृत प्रोटोकॉल 1 हर्ट्ज से 35 हर्ट्ज की आवृत्ति सीमा में लाल रक्त कोशिकाओं की रियोलॉजिकल विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जाता है। जबकि ऑप्टिकल ट्वीज़र्स का उपयोग एरिथ्रोसाइट-कॉम्प्लेक्स इलास्टिक स्थिरांक को मापने के लिए किया जाता है, डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी सेल ऊंचाई प्रोफ़ाइल, वॉल्यूम और इसके फॉर्म फैक्टर को एक पैरामीटर प्राप्त करने में सक्षम है जो जटिल लोचदार स्थिरांक को जटिल कतरनी मापांक में बदलने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल को लागू करते हुए, दोनों मोडुलिन के लिए स्केलिंग प्रतिपादक प्राप्त किया जा सकता है। विकसित पद्धति लाल रक्त कोशिकाओं के यांत्रिक व्यवहार का पता लगाने की अनुमति देती है, जो कई शारीरिक और रोग स्थितियों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत प्राप्त उनके विस्कोस्टिक मापदंडों को दर्शाती है।
Introduction
परिपक्व लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी), जिन्हें एरिथ्रोसाइट्स के रूप में भी जाना जाता है,मानव शरीर की सबसे संकीर्ण केशिकाओं से गुजरने पर अपने आकार से दोगुने से अधिक विस्तार करने में सक्षम हैं। इस तरह की क्षमता को बाहरी भार के अधीन होने पर विकृत करने की उनकी अनूठी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है।
हाल के वर्षों में, विभिन्न अध्ययनों ने आरबीसी सतहों 2,3 में इस सुविधा की विशेषता बताई है। भौतिकी का क्षेत्र जो बाहरी भार के कारण सामग्रियों की लोचदार और चिपचिपी प्रतिक्रियाओं का वर्णन करता है, उसे रियोलॉजी कहा जाता है। सामान्य तौर पर, जब एक बाहरी बल लागू किया जाता है, तो परिणामी विरूपण सामग्री के गुणों पर निर्भर करता है और इसे लोचदार विरूपण में विभाजित किया जा सकता है, जो ऊर्जा, या चिपचिपा विरूपण को संग्रहीत करता है, जो ऊर्जाको नष्ट करता है। आरबीसी सहित सभी कोशिकाएं, एक विस्कोस्टिक व्यवहार प्रदर्शित करती हैं; दूसरे शब्दों में, ऊर्जा संग्रहीत और विघटित दोनों है। इस प्रकार एक कोशिका की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया को इसके जटिल कतरनी मापांक G* (q) = G'(q) + iG” (q) द्वारा चिह्नित किया जा सकता है, जहां G‘ (q) भंडारण मापांक है, जो लोचदार व्यवहार से संबंधित है, और G“ (q) हानि मापांक है, जो इसकी चिपचिपाहट4 से संबंधित है। इसके अलावा, घटनात्मक मॉडल का उपयोग सेल प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया गया है, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले में से एक को नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल5 कहा जाता है, जो लोड आवृत्ति के साथ जटिल कतरनी मापांक की शक्ति-कानून निर्भरता की विशेषता है।
एकल-सेल-आधारित विधियों को आरबीसी के विस्कोस्टिक गुणों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया है, बल लागू करके और लगाए गए लोड 2,3 के कार्य के रूप में विस्थापन को मापकर। हालांकि, जटिल कतरनी मापांक के लिए, साहित्य में कुछ परिणाम पाए जा सकते हैं। गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग करते हुए, आरबीसी भंडारण और हानि मोडुलिन के मान 1-100 हर्ट्ज6 की आवृत्ति सीमा में 0.01-1 पीए से भिन्न बताए गए थे। ऑप्टिकल चुंबकीय घुमावदार साइटोमेट्री का उपयोग करके, एक स्पष्ट जटिल लोचदार मापांक7 प्राप्त किया गया था, और तुलना उद्देश्यों के लिए, संभवतः विसंगतियों को स्पष्ट करने के लिए एक गुणक कारक का दावा किया गया था।
हाल ही में, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स (ओटी) पर आधारित एक नई पद्धति, डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी (डीएम) के साथ, समय-निर्भर भार पर मानव एरिथ्रोसाइट्स के कतरनी मोडुलिन के भंडारण और हानि को मात्रात्मक रूप से मैप करने के लिए एक एकीकृत उपकरण के रूप में, 8,9 स्थापित किया गया था। इसके अलावा, परिणामों को फिट करने और एक शक्ति-कानून गुणांक प्राप्त करने के लिए एक नरम ग्लासी रियोलॉजी मॉडल का उपयोग किया गया था जो आरबीसी 8,9 की विशेषता है।
कुल मिलाकर, विकसित पद्धति8,9, जिसके लिए प्रोटोकॉल नीचे विस्तार से वर्णित है, फॉर्म फैक्टर, एफ एफ के लिए मापा मूल्यों का उपयोग करके पिछली विसंगतियों को स्पष्ट करता है, जो आरबीसी सतह में तनाव और उपभेदों के लिए बलों और विकृतियों से संबंधित है और इसका उपयोग एक नई नैदानिक विधि के रूप में किया जा सकता है जो मात्रात्मक रूप से विभिन्न रक्त वाले व्यक्तियों से प्राप्त आरबीसी के विस्कोस्टिक मापदंडों और नरम ग्लासी विशेषताओं को निर्धारित करने में सक्षम है। विकृति। इस तरह के लक्षण वर्णन, नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आरबीसी के व्यवहार को मेकेनोबायोलॉजिकल परिप्रेक्ष्य से समझने के लिए नई संभावनाएं खोल सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, आरबीसी के विस्कोस्टिक गुणों को मात्रात्मक रूप से मैप करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और डीफोकसिंग माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक एकीकृत विधि प्रस्तुत की जाती है। भंडारण और हानि कतरनी मोड…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक सभी महत्वपूर्ण सहायता के लिए CENABIO उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा के सभी सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को ब्राजील की एजेंसियों कॉन्सेल्हो नेसियोनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू), कोर्डेनाको डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) – फाइनेंशियल कोड 001, फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (एफएपीईआरपी) और इंस्टीट्यूटो नेसियोनल डी सिओनोलोजिको और टेक्नोलोगिया डी फ्लुडोस कॉम्प्लेक्सोस (आईएनसीटी-एफसीएक्स) द्वारा समर्थित किया गया था। बीपी को एफएपीईआरजे से जेसीएनई अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
