Denna metod utnyttjar bidraget från mitokondriell permeabilitetsövergångspor till protonläckage med låg konduktans för att bestämma spänningströskeln för poröppning hos neonatala bräckliga X-syndrommöss med ökat kardiomyocyt mitokondriellt koenzym Q-innehåll jämfört med vildtypskontroll.
Den mitokondriella permeabilitetsövergångsporen (mPTP) är en spänningsstyrd, icke-selektiv, inre mitokondriell membran (IMM) megakanal som är viktig för hälsa och sjukdom. mPTP förmedlar läckage av protoner över IMM under öppning med låg konduktans och hämmas specifikt av cyklosporin A (CsA). Koenzym Q (Q) är en regulator för mPTP, och vävnadsspecifika skillnader har hittats i Q-innehåll och öppen sannolikhet för mPTP i framhjärnan och hjärtmitokondrier i en nyfödd musmodell av bräckligt X-syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi utvecklade en teknik för att bestämma spänningströskeln för mPTP-öppning i denna mutantstam och utnyttjade mPTP: s roll som en protonläckkanal.
För att göra detta mättes syreförbrukning och membranpotential (ΔΨ) samtidigt i isolerade mitokondrier med hjälp av polarografi och en tetrafenylfosfonium (TPP+) jonselektiv elektrod under läckageandning. Tröskeln för mPTP-öppning bestämdes av uppkomsten av CsA-medierad hämning av protonläckage vid specifika membranpotentialer. Med hjälp av detta tillvägagångssätt definierades skillnader i spänningsgatning av mPTP exakt i samband med Q-överskott. Denna nya teknik kommer att möjliggöra framtida undersökningar för att förbättra förståelsen för fysiologisk och patologisk reglering av lågkonduktansöppning av mPTP.
mPTP förmedlar permeabilitetsövergången (PT), varigenom IMM blir plötsligt permeabel för små molekyler och löster 1,2. Detta slående fenomen är en tydlig avvikelse från IMM: s karakteristiska ogenomtränglighet, vilket är grundläggande för att fastställa den elektrokemiska gradienten som är nödvändig för oxidativ fosforylering3. PT, till skillnad från andra mitokondriella transportmekanismer, är en högkonduktans, ospecifik och icke-selektiv process, vilket möjliggör passage av en rad molekyler upp till 1,5 kDa 4,5. mPTP är en spänningsstyrd kanal inom IMM vars öppning förändrar ΔΨ, ATP-produktion, kalciumhomeostas, reaktiv syreart (ROS) produktion och cellviabilitet4.
Vid den patologiska extrema leder okontrollerad och långvarig högkonduktansöppning av mPTP till kollaps av den elektrokemiska gradienten, matrissvullnad, utarmning av matrispyridinnukleotider, yttre membranbrott, frisättning av intermembranproteiner (inklusive cytokrom c) och slutligen celldöd 4,6. Sådan patologisk mPTP-öppning har varit inblandad i hjärtischemi-reperfusionsskada, hjärtsvikt, traumatisk hjärnskada, olika neurodegenerativa sjukdomar och diabetes 1,7. MPTP-öppning med låg konduktans är emellertid fysiologisk till sin natur och leder i motsats till högkonduktansöppning inte till djup depolarisering eller mitokondriell svullnad4.
Lågkonduktansöppning av poren begränsar permeabiliteten till ~ 300 Da, tillåter passage av protoner oberoende av ATP-syntes och är en potentiell källa till fysiologisk protonläcka5. Fysiologisk mPTP-öppning orsakar en kontrollerad nedgång i ΔΨ, ökar elektronflödet genom andningstransportkedjan och resulterar i en kort burst eller blixt av superoxid, vilket bidrar till ROS-signalering8. Reglering av sådan övergående mPTP-öppning är viktig för kalciumhomeostas och normal cellulär utveckling och mognad 4,9,10,11. Övergående poröppning vid utveckling av neuroner utlöser till exempel differentiering, medan stängningen av mPTP inducerar mognad i omogna kardiomyocyter 4,5.
Även om den funktionella betydelsen av mPTP i hälsa och sjukdom är väl etablerad, är dess exakta molekylära identitet fortfarande debatterad. Framstegen när det gäller mPTP:s molekylära struktur och funktion har granskats utförligt på annat håll12. Kortfattat har för närvarande hög- och lågkonduktanstillstånd för mPTP antagits förmedlas av distinkta enheter12. De ledande kandidaterna är F1/F0 ATP-syntas (ATP-syntas) och adeninnukleotidtransportör (ANT) för hög- respektive lågkonduktanslägen12.
Trots bristen på konsensus om den exakta identiteten hos den porbildande komponenten i mPTP har vissa nyckelegenskaper beskrivits. En väletablerad egenskap hos mPTP är att den regleras av den elektrokemiska gradienten så att depolarisering av IMM leder till poröppning13. Tidigare arbete har visat att redoxtillståndet för vicinala tiolgrupper förändrar spänningskopplingen hos mPTP, så att oxidation öppnar poren vid relativt högre ΔΨs, och tiolgruppsreduktion resulterar i sluten mPTP-sannolikhet14. Identiteten hos den proteinhaltiga spänningssensorn är emellertid okänd.
Olika små molekyler som modulerar porens öppna sannolikhet har identifierats. Till exempel kan mPTP stimuleras att öppna med kalcium, oorganiskt fosfat, fettsyror och ROS och kan hämmas av adeninnukleotider (särskilt ADP), magnesium, protoner och CsA 5,12. Verkningsmekanismerna hos vissa av dessa tillsynsmyndigheter har belysts. Mitokondriellt kalcium utlöser mPTP-öppning åtminstone delvis genom att binda till β-underenheten i ATP-syntas15. ROS kan aktivera mPTP genom att minska dess affinitet för ADP och förbättra dess affinitet för cyklofilin D (CypD), den bäst studerade proteinhaltiga mPTP-aktivatorn16. Mekanismen för aktivering av mPTP med oorganiskt fosfat och fettsyror är mindre tydlig. När det gäller endogena hämmare tros ADP hämma mPTP genom att binda vid ANT- eller ATP-syntaset, medan magnesium utövar sin hämmande effekt genom att förskjuta kalcium från dess bindningsställe 15,17,18,19.
Lågt pH hämmar mPTP-öppningen genom att protonera histidin 112 av den regulatoriska oligomycinkänslighetsgivande protein (OSCP) -underenheten i ATP-syntaset 12,20,21. Den prototypiska farmakologiska hämmaren av mPTP, CsA, verkar genom att binda CypD och förhindra dess koppling till OSCP 22,23. Tidigare arbete har också visat att en mängd olika Q-analoger interagerar med mPTP, hämmar den eller aktiverar den24. I det senaste arbetet fann vi bevis på en patologiskt öppen mPTP, överdriven protonläcka och ineffektiv oxidativ fosforylering på grund av en Q-brist i mitokondrier i framhjärnan hos nyfödda FXS-musungar25.
Stängning av poren med exogen q blockerade den patologiska protonläckan och inducerade morfologisk mognad hos dendritiska ryggar25. Intressant nog hade FXS-kardiomyocyter hos samma djur överdrivna Q-nivåer och sluten mPTP-sannolikhet jämfört med vildtypskontroller26. Även om orsaken till dessa vävnadsspecifika skillnader i Q-nivåer är okänd, understryker resultaten konceptet att endogen q sannolikt är en nyckelregulator för mPTP. Det finns dock ett stort gap i vår kunskap eftersom mekanismen för Q-medierad hämning av mPTP fortfarande är okänd.
Reglering av mPTP är en kritisk determinant för cellsignalering och överlevnad4. Således är det viktigt att detektera mPTP-öppning inom mitokondrier när man överväger specifika patofysiologiska mekanismer. Vanligtvis bestäms tröskeln för poröppning med hög konduktans med användning av kalcium för att utlösa permeabilitetsövergången. Sådan kalciumbelastning leder till kollaps av membranpotentialen, snabb frikoppling av oxidativ fosforylering och mitokondriell svullnad27,28. Vi försökte utveckla en metod för att detektera mPTP-öppning med låg konduktans in situ, utan att inducera det i sig.
Tillvägagångssättet utnyttjar mPTP: s roll som en protonläckkanal. För att göra detta användes Clark-Type och TPP + jonselektiva elektroder för att samtidigt mäta syreförbrukning respektive membranpotential i isolerade mitokondrier under läckageandning29. Tröskeln för mPTP-öppning bestämdes av uppkomsten av CsA-medierad hämning av protonläckage vid specifika membranpotentialer. Med hjälp av detta tillvägagångssätt definierades skillnader i spänningstilldelning av mPTP i samband med Q-överskott exakt.
Detta dokument beskriver en metod för att bedöma den öppna sannolikheten för mPTP. Specifikt bestämdes spänningströskeln för mPTP-öppning med låg konduktans genom att bedöma effekten av CsA-hämning på protonläckage över ett intervall av ΔΨs. Med hjälp av denna teknik kunde vi identifiera skillnader i spänningsgavel av mPTP mellan FXS-möss och FVB-kontroller som överensstämmer med deras skillnader i vävnadsspecifikt Q-innehåll. Avgörande för framgången med denna metod är att mitokondrier är ny…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av följande bidrag: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award till Institutionen för anestesiologi (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) och NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |