Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.

Abstract

נקבובית מעבר החדירות המיטוכונדרית (mPTP) היא ממברנה מיטוכונדריאלית פנימית מגודרת מתח, לא סלקטיבית ופנימית (IMM) בעלת תעלת ענק החשובה בבריאות ובמחלות. ה-mPTP מתווך דליפה של פרוטונים על פני ה-IMM במהלך פתיחת מוליכות נמוכה, והוא מעוכב באופן ספציפי על-ידי ציקלוספורין A (CsA). קו-אנזים Q (CoQ) הוא מווסת של ה-mPTP, והבדלים ספציפיים לרקמות נמצאו בתוכן ה-CoQ ובהסתברות הפתוחה של ה-mPTP במיטוכונדריה של המוח הקדמי והלב במודל עכבר שזה עתה נולד של תסמונת X שברירית (FXS, Fmr1 knockout). פיתחנו טכניקה לקביעת סף המתח של פתיחת mPTP בזן מוטנטי זה, תוך ניצול תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים.

לשם כך, צריכת החמצן ופוטנציאל הממברנה (ΔΨ) נמדדו בו זמנית במיטוכונדריה מבודדת באמצעות פולרוגרפיה ואלקטרודה סלקטיבית יונים של טטרפניל פוספוניום (TPP+) במהלך נשימת דליפה. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP הוגדרו במדויק בהקשר של עודף CoQ. טכניקה חדשנית זו תאפשר חקירה עתידית לשיפור ההבנה של רגולציה פיזיולוגית ופתולוגית של פתיחת מוליכות נמוכה של mPTP.

Introduction

ה-mPTP מתווך את מעבר החדירות (PT), לפיו ה-IMM הופך להיות חדיר בפתאומיות למולקולות קטנות ומומס 1,2. תופעה בולטת זו היא סטייה מובהקת מהאטימות האופיינית של ה-IMM, שהיא בסיסית לביסוס השיפוע האלקטרוכימי הנחוץ לזרחון חמצוני3. PT, בניגוד למנגנוני הובלה מיטוכונדריאליים אחרים, הוא תהליך בעל מוליכות גבוהה, לא ספציפי ולא סלקטיבי, המאפשר מעבר של טווח מולקולות עד 1.5 kDa 4,5. ה-mPTP הוא ערוץ מגודר מתח בתוך ה-IMM שפתיחתו משנה את ΔΨ, ייצור ATP, הומאוסטזיס של סידן, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וכדאיות תאים4.

בקיצוניות הפתולוגית, פתיחה בלתי מבוקרת וממושכת של מוליכות גבוהה של mPTP מובילה לקריסת השיפוע האלקטרוכימי, התנפחות מטריצה, דלדול של נוקלאוטידים של מטריצה פירידין, קרע בממברנה החיצונית, שחרור חלבונים אינטר-ממברניים (כולל ציטוכרום c), ובסופו של דבר, מוות תאי 4,6. פתיחת mPTP פתולוגית כזו הייתה מעורבת בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה לבבית, אי ספיקת לב, פגיעה מוחית טראומטית, מחלות נוירודגנרטיביות שונות וסוכרת 1,7. עם זאת, פתיחת mPTP בהולכה נמוכה היא פיזיולוגית באופיה, ובניגוד לפתיחה בהולכה גבוהה, אינה מובילה לדה-פולריזציה עמוקה או לנפיחות מיטוכונדריאלית4.

פתיחה עם מוליכות נמוכה של הנקבובית מגבילה את החדירות לכ-300 Da, מאפשרת מעבר של פרוטונים ללא תלות בסינתזת ATP, ומהווה מקור פוטנציאלי לדליפת פרוטונים פיזיולוגית5. פתיחת mPTP פיזיולוגית גורמת לירידה מבוקרת ב-ΔΨ, מגבירה את שטף האלקטרונים דרך שרשרת ההובלה הנשימתית, וגורמת לפרץ קצר או הבזק של סופראוקסיד, מה שתורם לאותת ROS8. ויסות של פתיחת mPTP חולפת כזו חשוב להומאוסטזיס של סידן ולהתפתחות תקינה של התאיםולהבשלתם 4,9,10,11. פתיחת נקבוביות חולפת בתאי עצב מתפתחים, למשל, מעוררת התמיינות, בעוד שסגירת ה-mPTP גורמת להבשלה אצל קרדיומיוציטים לא בשלים 4,5.

למרות שהמשמעות התפקודית של ה-mPTP בבריאות ובמחלות מבוססת היטב, הזהות המולקולרית המדויקת שלו עדיין נתונה לוויכוח. ההתקדמות במבנה המולקולרי ובתפקוד של ה-mPTP נבדקה באופן מקיף במקום אחר12. בקצרה, נכון לעכשיו, ההשערה היא שמצבי מוליכות גבוהים ונמוכים של ה-mPTP מתווכים על ידי ישויות מובחנות12. המועמדים המובילים הם F1/F0 ATP סינתאז (ATP synthase) וטרנספורטר נוקלאוטידים אדנין (ANT) למצבי מוליכות גבוהה ונמוכה, בהתאמה12.

למרות חוסר ההסכמה לגבי הזהות המדויקת של המרכיב יוצר הנקבוביות של ה-mPTP, מפורטים מאפיינים מרכזיים מסוימים. תכונה מבוססת היטב של mPTP היא שהוא מווסת על ידי השיפוע האלקטרוכימי כך שדה-פולריזציה של ה- IMM מובילה לפתיחת נקבוביות13. עבודות קודמות הראו כי מצב החמצן מחדש של קבוצות תיול ויצינליות משנה את טמפרטורת המתח של ה-mPTP, כך שחמצון פותח את הנקבובית ב-ΔΨs גבוהים יחסית, והפחתת קבוצת תיול גורמת להסתברות mPTP סגורה14. עם זאת, זהותו של חיישן המתח החלבון אינה ידועה.

זוהו מולקולות קטנות שונות המווסתות את ההסתברות הפתוחה של הנקבובית. לדוגמה, ניתן לעורר את ה-mPTP להיפתח עם סידן, פוספט אנאורגני, חומצות שומן ו-ROS, והוא יכול להיות מעוכב על ידי נוקלאוטידים אדנין (במיוחד ADP), מגנזיום, פרוטונים ו-CsA 5,12. מנגנוני הפעולה של חלק מהרגולטורים הללו הובהרו. סידן מיטוכונדריאלי מפעיל את פתיחת ה-mPTP לפחות בחלקה על ידי קשירת תת-היחידה β של ה-ATP synthase15. ROS יכול להפעיל את ה-mPTP על ידי הפחתת הזיקה שלו ל-ADP והגברת הזיקה שלו לציקלופילין D (CypD), מפעיל ה-mPTP החלבון הנחקר ביותר16. מנגנון ההפעלה של mPTP על ידי פוספט אנאורגני וחומצות שומן הוא פחות ברור. באשר למעכבים אנדוגניים, ADP נחשב כמעכב את ה-mPTP על ידי קשירת ANT או ATP synthase, בעוד שמגנזיום מפעיל את השפעתו המעכבת על ידי הרחקת סידן מאתר הקישור שלו 15,17,18,19.

pH נמוך מעכב את פתיחת ה-mPTP על-ידי פרוטונציה של היסטידין 112 של תת-היחידה הרגולטורית של תת-היחידה המעניקה רגישות לאוליגומיצין (OSCP) של ה-ATP synthase 12,20,21. המעכב הפרמקולוגי האבטיפוסי של mPTP, CsA, פועל על ידי קשירת CypD ומניעת הקשר שלו עם OSCP22,23. עבודות קודמות הראו גם כי מגוון אנלוגים של CoQ מתקשרים עם mPTP, מעכבים אותו או מפעילים אותו24. בעבודה האחרונה מצאנו עדויות ל-mPTP פתוח פתולוגית, דליפת פרוטונים מוגזמת וזרחון חמצוני לא יעיל עקב מחסור ב-CoQ במיטוכונדריה קדמית של גורי עכברי FXS שזה עתה נולדו25.

סגירת הנקבובית עם CoQ אקסוגני חסמה את דליפת הפרוטונים הפתולוגיים וגרמה לבגרות מורפולוגית של עמודי שדרה דנדריטיים25. באופן מעניין, באותם בעלי חיים, קרדיומיוציטים של FXS היו בעלי רמות CoQ מוגזמות והסתברות mPTP סגורה בהשוואה לבקרות wildtype26. אף על פי שהסיבה להבדלים ספציפיים לרקמות אלה ברמות ה-CoQ אינה ידועה, הממצאים מדגישים את הרעיון ש-CoQ אנדוגני הוא ככל הנראה הרגולטור המרכזי של ה-mPTP. עם זאת, יש פער גדול בידע שלנו מכיוון שהמנגנון של עיכוב בתיווך CoQ של ה-mPTP עדיין אינו ידוע.

ויסות ה-mPTP הוא גורם מכריע באיתות התאובהישרדותו 4. לפיכך, גילוי פתיחת mPTP בתוך המיטוכונדריה הוא המפתח כאשר בוחנים מנגנונים פתופיזיולוגיים ספציפיים. בדרך כלל, הסף לפתיחת נקבוביות בעל מוליכות גבוהה נקבע באמצעות סידן כדי להפעיל את מעבר החדירות. העמסת סידן כזו מובילה לקריסת פוטנציאל הממברנה, לניתוק מהיר של זרחון חמצוני ולנפיחות מיטוכונדריאלית27,28. ביקשנו לפתח שיטה לאיתור פתיחת mPTP עם מוליכות נמוכה באתרה, מבלי לגרום לה כשלעצמה.

הגישה מנצלת את תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים. לשם כך, נעשה שימוש באלקטרודות סלקטיביות מסוג קלארק ו-TPP+ כדי למדוד בו-זמנית את צריכת החמצן ואת פוטנציאל הממברנה, בהתאמה, במיטוכונדריה מבודדת במהלך נשימת דליפה29. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של mPTP בהקשר של עודף CoQ הוגדרו במדויק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה התקבל עבור כל השיטות שתוארו. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) ובקרה (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) עכברים המשמשים כמערכות המודל למחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראו טבלת החומרים). בכל קבוצת ניסוי נעשה שימוש בחמישה עד 11 בעלי חיים. עכברים לאחר יום 10 (P10) לאחר הלידה שימשו כדי לדגמן נקודת זמן בינקות אנושית.

1. בידוד מיטוכונדריאלי מלב העכבר

  1. הכינו מאגרים לניסויים בבידוד מיטוכונדריאלי ובהנשמה, כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם נעשה מראש.
    1. הכן מדיום שיפוע צפיפות של 15%: דילל את מדיום שיפוע הצפיפות המסחרית עד 80% נפח/נפח (v/v) עם מדולל שיפוע צפיפות. דילול נוסף של 80% שיפוע צפיפות בינוני 15% v/v על ידי הוספת מאגר בידוד מיטוכונדריאלי (MI)/אלבומין סרום בקר (BSA).
  2. מבודדים את המיטוכונדריה מרקמה טרייה ולא קפואה לניסויים אלה ומשתמשים בהם ביום ההכנה, בדרך כלל תוך חמש שעות26. בצע את כל שלבי הבידוד על הקרח.
    1. ערפו את העכבר והבלו את הלב. יש לשטוף מיד 1-2 פעמים בצלחת פטרי עם MI/BSA קר כקרח. חותכים את האטריום וכורעים את הרקמה.
    2. העבר את רקמת הלב הטחונה להומוגנייזר זכוכית המכיל 1 מ"ל של MI/BSA. הומוגני עם מזיק רופף יותר (A) (10 פעימות), ולאחר מכן הדברה הדוקה יותר (B) (10 משיכות).
    3. צנטריפוגה ההומוגנטית ב 1,100 × גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (64 °F) כדי להסיר פסולת גרעינית תאית.
    4. קחו את הסופרנטנט בעדינות מבלי לגעת בשום כדור רך, ושכבו אותו בזהירות על גבי 700 μL של 15% צפיפות הדרגתית בינונית בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 18,500 × גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. Resuspend את הכדור ב 1 מ"ל של חיץ סוכרוז (SB)/BSA וצנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (76 °F).
    6. להסיר לחלוטין ולהשליך את supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור ב-SB/BSA לנפח סופי של 55 μL.
    7. לכמת את תכולת החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות בדיקה סטנדרטית כגון בדיקת החלבון חומצה ביסינצ'ונינית (BCA).

2. צריכת חמצן מיטוכונדריאלי (O2) ו-ΔΨ

  1. הרכבה וכיול של אלקטרודות חמצן
    1. הגדר וכייל את אלקטרודת החמצן (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
      1. הניחו טיפה של תמיסת אלקטרוליטים של 50% אשלגן כלורי (KCl) על גבי כיפת דיסק האלקטרודה.
      2. הניחו חתיכה קטנה בגודל שלכ-2 ס"מ 2 ספייסר נייר סיגריות מכוסה בחתיכה מעט גדולה יותר של קרום הפוליטטרפלואורואתילן (PTFE) המסופק על גבי טיפת האלקטרוליטים.
      3. באמצעות כלי המוליך שסופק, לדחוף את דיסק האלקטרודה הקטן O-ring מעל כיפת האלקטרודה.
        הערה: ודא שאין בועות אוויר ושהקרום חלק.
    2. מלאו את המאגר היטב בתמיסת האלקטרוליטים.
    3. הניחו את טבעת ה-O הגדולה יותר בהפסקה סביב דיסק האלקטרודה היטב.
    4. התקן את הדיסק בתא האלקטרודה וחבר אותו ליחידת הבקרה.
    5. הוסיפו 2 מ"ל של מים רוויי אוויר לתא התגובה ואת המגנט המצופה ב-PTFE לתא.
    6. חבר את התא לחלק האחורי של יחידת הבקרה.
    7. הגדר את הטמפרטורה ל-37 °C (74 °F) ואת מהירות הערבוב ל-100 מעלות צלזיוס.
    8. אפשרו 10 דקות לטמפרטורת המערכת להתיישב לפני תחילת הכיול.
    9. תחת הכרטיסייה כיול , בחר כיול פאזה נוזלית כדי לבצע כיול פאזה נוזלית. אשרו כי הטמפרטורה מוגדרת ל -37 מעלות צלזיוס , מהירות הערבוב היא 100, והלחץ מוגדר ללחץ אטמוספרי (101.32 kPa).
    10. לחץ על אישור והמתן עד שהאות יתיישר.
    11. כאשר מגיעים למישור, לחץ על אישור.
    12. קבעו אפס O2 בתא על ידי הוספת כמות קטנה (כ-20 מ"ג) של נתרן דיתיוניט.
    13. לחץ על אישור והמתן עד שהאות יתיישר.
    14. כאשר מגיעים למישור, לחץ על שמור כדי לקבל את הכיול.
  2. מכלול אלקטרודות סלקטיבי TPP+-סלקטיבי
    1. מלאו את קצה האלקטרודה הסלקטיבית TPP+ בתמיסת TPP של 10 mM באמצעות המזרק המסופק והמחט הגמישה, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר.
    2. הרכיבו את מנגנון האלקטרודות הסלקטיבי TPP+, כולל אלקטרודת הייחוס ומחזיק האלקטרודה (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    3. בקצרה, שחררו את מכסה מחזיק האלקטרודה והכניסו את אלקטרודת הייחוס הפנימית לקצה TPP+. הדקו את המכסה כדי לאבטח את הקצה. חבר את הכבל המסופק למחזיק האלקטרודה וליציאת העזר של תיבת הבקרה.
    4. הכנס את האלקטרודה הסלקטיבית TPP+-סלקטיבית ואלקטרודות ייחוס למכלול הבוכנה המותאם לאלקטרודות סלקטיביות יונים. חבר את אלקטרודת הייחוס ליציאת הייחוס של תיבת הבקרה.
    5. הכנס את האלקטרודות הסלקטיביות והייחוס TPP+ למכלול הבוכנה המותאם לאלקטרודות סלקטיביות של יונים.
  3. הכנת תא תגובה
    1. הוסף את תערובת התגובה לתא התגובה: 10 mM סוקסינט (מצע II מורכב), רוטנון 5 μM (מעכב I מורכב), 80 ננוגרם מ"ל−1 ניז'ריצין (כדי לכווץ שיפוע pH על פני IMM), 2.5 מיקרוגרם מ"ל-1 אוליגומיצין (כדי לגרום למצב נשימה 4), וחיץ תגובה של נשימה (RB)/BSA לנפח סופי של 1 מ"ל. הקפידו להימנע מהכנסת בועות אוויר לחדר.
    2. סגור את התא עם מכלול הבוכנה המותאם עם ה-TPP+-סלקטיבי ואלקטרודת הייחוס במקומה. בחר GO כדי להתחיל להקליט. לאחר סגירת התא, הכנס ריאגנטים נוספים ישירות לתמיסת התגובה באמצעות מיקרו-מזרקים נפרדים ששונו עם צינורות פלסטיק כדי להתאים את אורך המחט.
  4. כיול TPP+
    1. לאחר קבלת אות מתח יציב, כייל את האלקטרודה הסלקטיבית TPP+ על ידי הוספת 1 μM דרגות של תמיסת TPP של 0.1 mM לריכוז סופי של 3 μM. שימו לב שיש ירידה לוגריתמית באות המתח TPP+ עם כל תוספת.
      הערה: כייל את האלקטרודה הסלקטיבית TPP+ בתחילת כל ניסוי.
  5. רכישת נתונים
    1. אפשרו לעקבות O2 ו-TPP+ להתייצב, והוסיפו 100 מיקרוגרם של מיטוכונדריה קרדיומיוציטים שהוכנו זה עתה לתא התגובה לריכוז סופי של 0.1 מ"ג מ"ל-1 באמצעות יציאת תוספת הריאגנטים במכלול הבוכנה. שימו לב לירידה ברמות O2 בתא כאשר המיטוכונדריה הופכת להיות אנרגטית וצורכת את O2 ואת העלייה הפתאומית באות המתח TPP+ כאשר המיטוכונדריה מייצרת פוטנציאל ממברנה ולוקחת TPP+ מהתמיסה.
    2. הוסף 2.5 מיקרוגרם מ"ל-1 אוליגומיצין כדי לגרום למצב 4 נשימה.
      הערה: שיעורי הצריכה של O2 ייצגו כעת את קצב הנשימה של דליפת פרוטונים. ניתן להוסיף אוליגומיצין לתא התגובה לפני TPP+ כחלופה.
  6. הערכת ההסתברות הפתוחה של mPTP
    1. שימו לב ש-ΔΨ יורד עם הזמן במהלך נשימת דליפה. לאחר ההגעה ל- ΔΨ הרצוי, הוסף 1 μM CsA (מעכב mPTP) לתא התגובה כדי להעריך את ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP באותו ΔΨ ספציפי.
    2. מדוד את ההשפעה של CsA על צריכת O2 ו- ΔΨ לפני ואחרי הוספת CsA
    3. קבע את תלות המתח של פתיחת mPTP על ידי שינוי ה- ΔΨ שבו CsA מתווסף בניסויים עוקבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עקומות אופייניות של צריכת O2 ו-ΔΨ שנוצרו בניסויים אלה מוצגות (איור 1A,B). הירידה הלוגריתמית באות המתח עם כיול TPP+ מוצגת בתחילת כל ניסוי. היעדרה של תבנית לוגריתמית זו עשוי להצביע על בעיה באלקטרודה הסלקטיבית TPP+. מיטוכונדריה בדרך כלל מייצרת ΔΨ מיד עם תוספת למאגר הנשימה. ניתן לפרש את ΔΨ משינויים במתח TPP+ בהתבסס על משוואת נרנסט (יחס לוגריתמי של [TPP+ בתוך מטריצה מיטוכונדריאלית] ל-[TPP+])30 חיצוני. שים לב ש- ΔΨ פיזיולוגי מעריך את רמת 2 μM TPP+ של העקומה הסטנדרטית. לפיכך הוגדרו ספי מתח ביחס לתקן 2 μM TPP+ (מסומן כאות מתח Δ mV TPP+).

לדוגמה, "ΔΨ גבוה" הוגדר כ~Δ0 mV (ברמת 2 μM TPP+), "ΔΨ ביניים" הוגדר על ~Δ5 mV (מתחת ל-2 μM TPP+), ו-"low ΔΨ" הוגדר על ~Δ10 mV (מתחת ל-2 μM TPP+) (איור 1A,B). בניסויי פיילוט, מיטוכונדריה ב-Δ0 mV הפגינו הסתברות סגורה של 100% mPTP ואלה ב-Δ10 mV הפגינו הסתברות פתוחה של 100%; גרפים מייצגים מוצגים באיור 1A,B. סף Δ5 mV נבחר אפוא באופן שרירותי כ-ΔΨ ביניים. שימו לב שבניסויים אלה, עם הוספת המיטוכונדריה לתא התגובה, המיטוכונדריה נמצאת במצב נשימה 2 שבו הם נחשפים למצע עודף. המיטוכונדריה אינה מגורה להיכנס למצב 3 עם ADP; כתוצאה מכך, לאחר הוספת אוליגומיצין, הם עוברים ישירות למצב 4 אוליגומיצין (נשימה דליפה). כתוצאה מכך, בדרך כלל לא נצפה הבדל ניכר בצריכת החמצן לאחר הוספת אוליגומיצין, מה שמרמז על כך שסינתאז ה-ATP תורם באופן מינימלי לנשימה במהלך מצב 2 (איור 1A,B). כדי להעריך את המצב הפתוח או הסגור של ה-mPTP, משווים את קצב הצריכה של O2 ואת פוטנציאל הממברנה רגע לפני ומיד אחרי הוספת CsA (איור 1C). ירידה בקצב הצריכה של O2 ועלייה וייצוב של ΔΨ בתגובה ל-CsA מצביעים על סגירה של mPTP פתוח (חסימה של דליפת פרוטונים בתיווך נקבוביות) (איור 1C, עקומות שחורות).

כאשר ה-mPTP סגור, אין ירידה בקצב הצריכה של O2 , ו-ΔΨ אינו עולה ומתייצב אלא ממשיך לרדת (איור 1C, עקומות אדומות). תוצאות הניסוי מדגימות הסתברויות mPTP סגורות ופתוחות דומות ב-ΔΨs גבוהים ונמוכים, בהתאמה, בבקרת FVB ובמיטוכונדריה לבבית Fmr1 KO (איור 1D). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם תכונות ידועות רגישות למתח של ה-mPTP, כאשר הנקבובית נוטה להיות סגורה ב-ΔΨs גבוה ולפתוח ב-ΔΨs13 נמוך. לכן, באמצעות שיטה זו, הדגמנו באופן אמין את תלות המתח הרגילה של mPTP בשני הזנים. באופן מעניין, ב-ΔΨ (סף Δ5 mV) הבינוני, מיטוכונדריה לבבית Fmr1 KO הדגימה הסתברות מוגברת ל-mPTP סגור בהשוואה לבקרות FVB (איור 1D). לפיכך, מיטוכונדריה לבבית Fmr1 KO הדגימה שינוי ב- gating כך שהנקבובית דרשה ΔΨ נמוך יותר כדי שהפתח יופעל. זה עולה בקנה אחד עם הממצא הקודם כי ל- Fmr1 KOs יש רמות גבוהות של CoQ ו- mPTP26 סגור יחסית. לפיכך, השיטה זיהתה סף ΔΨ אופטימלי כדי לפתור הבדלים בפתיחת mPTP. חשוב לציין שהגדרת סף ΔΨ זה תאפשר חקירה נוספת כדי להבין טוב יותר כיצד CoQ מווסת את ה-mPTP וכיצד מחסור ב-CoQ מוביל לפתיחת נקבוביות פתולוגיות ב-FXS.

Figure 1
איור 1: זיהוי של הסתברות פתוחה ל-mPTP בעל מוליכות נמוכה. (A, B) עקומות מייצגות של צריכת O2 סימולטנית (אדום, מספרים הם שיעורים ב-nmol של O2 mL-1 min-1 mg protein-1) עם ΔΨ (שחור, [TPP+]). חצים מציינים את התוספת של TPP+, מיטוכונדריה, אוליגומיצין ו-CsA. מוצגים ספי מתח גבוהים, בינוניים ונמוכים ביחס לרמת הכיול של 2 μM TPP+. מוצגת תוספת של CsA בספי מתח גבוהים (A) ונמוכים (B). (C) מקטע מוגדל של עקומות צריכת O2 (עליון) ו-ΔΨ (תחתון) ב-(A) ו-(B) בנקודת התוספת CsA, הממחיש mPTP סגור (אדום) ב-ΔΨ גבוה (לא רגיש ל-CsA) ו-mPTP פתוח (שחור) ב-ΔΨ נמוך (רגיש ל-CsA). (D) גרפים מסכמים של מצב mPTP פתוח וסגור ב- ΔΨs גבוהים, נמוכים ובינוניים מוצגים עבור פקדי FVB (שחור) ו- Fmr1 KOs (אפור). חמישה עד 11 בעלי חיים הוערכו בכל סף ΔΨ; ערכי p חושבו באמצעות מבחן צ'י בריבוע, *p < 0.05. קיצורים: ΔΨ = פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית; mPTP = נקבוביות מעבר חדירות מיטוכונדריאליות; TPP+ = טטרפנילפוספוניום; mito = מיטוכונדריה; אוליגו = אוליגומיצין; CsA = ציקלוספורין A; ΔΨ = ; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

רכיב MI/BSA* SB/BSA* צפיפות שיפוע דילול RB/BSA*
מניטול 225 mM - - -
סוכרוז 75 mM 250 mM 1 מ' 200 mM
HEPES 5 מ"מ 5 מ"מ 50 mM 5 מ"מ
EGTA 1 מ"מ 0.1 מ"מ 10 mM -
KCl - - - 25 mM
KH2PO4 - - - 2 מ"מ
MgCl2 - - - 5 מ"מ
pH** 7.4 7.4 - 7.2
BSA*** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 מ"מ

טבלה 1: מאגרים ופתרונות.
* סינון דרך מסנני 0.2 מיקרומטר
**התאם את ה-pH עם 3 M אשלגן הידרוקסיד לפי הצורך.
מציין רכיבי מאגר שנוספו ממש לפני הבידוד המיטוכונדריאלי.
קיצורים: MI = חיץ בידוד מיטוכונדריאלי; SB = מאגר סוכרוז; RB = חיץ נשימה; BSA = אלבומין סרום בקר ללא חומצות שומן; HEPES = 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין-חומצה אתאנסולפונית; EGTA = אתילן גליקול-ביס(אתר β-אמינואתיל)-N,N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית; KCl = אשלגן כלורי; KH2PO4 = אשלגן דיהידרוגן פוספט; MgCl2 = מגנזיום כלוריד; AP5A = P1,P5-דיאדנוזין-5' פנטפוספט פנטסודיום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה להערכת ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP. באופן ספציפי, סף המתח לפתיחת mPTP בהולכה נמוכה נקבע על ידי הערכת ההשפעה של עיכוב CsA על דליפת פרוטונים בטווח של ΔΨs. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לזהות הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP בין עכברי FXS לבקרות FVB התואמים את ההבדלים ביניהם בתכולת ה-CoQ הספציפית לרקמות. קריטי להצלחתה של מתודולוגיה זו הוא כי המיטוכונדריה מבודדים טריים לפני השימוש והם באיכות טובה. מיטוכונדריה שניזוקה במהלך הבידוד או ישנה מדי לא תוכל לייצר ΔΨ מתאימה ובדרך כלל לא תהיה מחוברת. שים לב שבעוד ש-pH של מטריצה תורמת בדרך כלל לכוח המניע של הפרוטונים, ניגריצין משמש לקריסת ΔpH על פני ה-IMM בניסויים אלה, כפי שתואר קודם לכן בפרוטוקולים סטנדרטיים המעריכים דליפת פרוטונים29. לכן, במקרה זה, כוח המניע של הפרוטונים שווה ערך ל- ΔΨ, מה שמפשט את הגישה הניסויית.

שיקול חשוב נוסף הוא שחלק מהמעכבים המשמשים בתערובת הנשימה (כגון רוטנון, אוליגומיצין ו-CsA) קשים לשטיפה בין הניסויים מכיוון שהם נצמדים למשטחי פלסטיק של תא התגובה, כולל האלקטרודות הסלקטיביות של היונים. יש לשטוף את החדר באופן שגרתי באתנול ובהשעיה של מיטוכונדריה מופשרת בהקפאה שהוכנה באופן גס כדי "לנגב" את המעכבים הללו מהתא ולהפחית את הסבירות לנשיאת מעכבים שיכולה להשפיע על יכולת השכפול של הניסויים.

מכיוון שהמיטוכונדריה חייבת להיות מוכנה זה עתה כדי לשמור על שלמותן, שיטה זו אינה מקובלת על ניתוחים בעלי תפוקה גבוהה. בנוסף, יש צורך בכמויות גדולות יחסית של מיטוכונדריה לכל ניסוי. בדרך כלל, עבור חיות P10, ניתן לבודד מספיק מיטוכונדריה מאיבר אחד כדי לערוך ניסוי יחיד. לכן, בדיקת תנאים שונים על אותה קבוצה של מיטוכונדריה אינה אפשרית בדרך כלל. אם מבוצעים ניסויים בבעלי חיים מבוגרים יותר, מגבלה זו פחות מהווה בעיה, בהתחשב בגודל הגדול יחסית של רקמות ואיברים.

קיימות מספר שיטות המתוארות היטב כדי לחקור את ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP במיטוכונדריה שלמה מבודדת. טכניקות, כגון נפיחות מטריצה מיטוכונדריאלית ומבחני העמסת סידן או יכולת שמירה, מפעילות בהכרח PT בעל מוליכות גבוהה ולכן אינן מאפשרות לחקור את פתיחת ההולכה הנמוכה הפיזיולוגית המעניינת בניסויים אלה28. טכניקת הידוק הטלאי מספקת שיטה רבת עוצמה וישירה לחקר התלות במתח של מצבי מוליכות גבוהה או נמוכה של mPTP31,32. עם זאת, זוהי טכניקה מייגעת, שבה ניתן ללמוד רק מיטוכונדריה אחת ומצב ניסיוני יחיד בכל פעם, מה שהופך את המחקרים ההשוואתיים לקשים יותר32,33.

בנוסף, הממברנה המיטוכונדרית החיצונית בדרך כלל משוקרת, והממברנה המיטוכונדרית הפנימית נקרעת בדרך כלל בשיטות הידוק התיקון המשמשות למיטוכונדריה מבודדת, מה שעלול לגרום לאובדן גורמי ויסות mPTP שאינם קשורים באופן הדוק ל-IMM31. פתיחה עם מוליכות נמוכה של ה-mPTP נחקרה גם באמצעות מגוון טכניקות פלואורסצנטיות שבדרך כלל משתמשות באסטר טטרה-מתיל-רהודמין (כדי להעריך שינויים ב-ΔΨ) לבדו או בשילוב עם קלצין, שהפלואורסצנציה התוך-מיטוכונדרית שלו רגישה להרוות קובלט כאשר ה-mPTP פתוח 8,34. עם זאת, בגישות מבוססות פלואורסצנציה, מכיוון ששינויים ב-ΔΨ באים לידי ביטוי כשינויים יחסיים בפלואורסצנציה, הגישה בדרך כלל אינה מאפשרת מדידה מדויקת של ΔΨ 8,34.

שיטה זו מספקת גישה חלופית חדשה להערכת פתיחת המוליכות הנמוכה של ה- mPTP ביחס ל- ΔΨ. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לחקור את הרגולציה של גרימת מתח mPTP פיזיולוגי ופתולוגי. טכניקה זו גם טומנת בחובה הבטחה לסייע בהבנת התפקיד ההתפתחותי של ה-mPTP בהבשלת איברים, שכן ניתן ליישם אותה על רקמות שונות ועל שלבי התפתחות שונים. ניתן ליישם גישה זו בקלות כדי לחקור את האצת המתח של ה-mPTP ברקמת המוח הקדמי של עכבר FXS, שהציגה בעבר ירידה ברמות CoQ25. יתר על כן, אנו מציעים כי טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור כיצד סוכנים אחרים, אנדוגניים או אקסוגניים, משפיעים על גרימת המתח של mPTP. לפיכך, הוא יתגלה ככלי שימושי להרחבת ההבנה של תרומת ה- mPTP לבריאות ולמחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), פרס המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה אירווינג יעד ההזדמנות למחלקה להרדמה (K.K.G.), פרס מחקר החוקר הצעיר של האגודה להרדמה בילדים (K.K.G.), ו- NIH/NINDS R01NS1112706 (R.J.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

ביולוגיה גיליון 184
הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter