Etablering af organoider fra menneskelig tand som et kraftfuldt værktøj mod mekanistisk forskning og regenerativ terapi
Summary
Vi præsenterer en protokol til udvikling af epitelorganoidkulturer startende fra menneskelig tand. Organoiderne er robust udvidelige og rekapitulerer tandens epitelstamceller, herunder deres ameloblastdifferentieringskapacitet. Den unikke organoidmodel giver et lovende værktøj til at studere human dental (stamcelle) biologi med perspektiver for tandregenerative tilgange.
Abstract
Tænder er af afgørende betydning i livet, ikke kun for madmastikation og tale, men også for psykologisk velvære. Viden om menneskets tandudvikling og biologi er knap. Især er der ikke meget kendt om tandens epitelstamceller og deres funktion. Det lykkedes os at udvikle en ny organoidmodel, der starter fra menneskeligt tandvæv (dvs. tandfollikel, isoleret fra ekstraherede visdomstænder). Organoiderne er robust og langsigtede udvidelige og rekapitulerer det foreslåede menneskelige tandepitel stamcellerum med hensyn til markørekspression såvel som funktionel aktivitet. Især er organoiderne i stand til at udfolde en ameloblastdifferentieringsproces som forekommer in vivo under amelogenese. Denne unikke organoidmodel vil give et kraftfuldt værktøj til at studere ikke kun menneskelig tandudvikling, men også tandpatologi og kan bane vejen for tandregenerativ terapi. Udskiftning af tabte tænder med en biologisk tand baseret på denne nye organoidmodel kan være et tiltalende alternativ til den nuværende standardimplantation af syntetiske materialer.
Introduction
Tænder har vigtige roller i madmastikation, tale og psykologisk velvære (selvbillede). Den menneskelige tand består af stærkt mineraliserede væv med varierende tæthed og hårdhed1. Tandemalje, hovedkomponenten i tandkronen, er det højeste mineraliserede væv i menneskekroppen. Under emaljedannelse (amelogenese), når tænderne udvikler sig, differentierer dental epitelstamceller (DESC’er) sig til emaljedannende celler (ameloblaster). Når emaljen er dannet, repareres eller fornyes emaljen sjældent på grund af det apoptotiske tab af ameloblasterne ved begyndelsen af tandudbrud1. Restaurering af beskadiget emaljevæv, som forårsaget af traume eller bakteriel sygdom, udføres i øjeblikket ved hjælp af syntetiske materialer; disse er dog plaget af vigtige mangler såsom mikroleakage, ringere osseointegration og forankring, begrænset levetid og mangel på fuldt funktionel reparation2. Derfor ville en robust og pålidelig kultur af humane DESC’er med kapacitet til at generere ameloblaster og potentialet til at producere mineraliseret væv være et stort skridt fremad på det dentalregenerative område.
Viden om human DESC-fænotype og biologisk funktion er knap 3,4,5. Interessant nok er DESC’er af menneskelige tænder blevet foreslået at eksistere i Epitelcelle hviler af Malassez (ERM), celleklynger til stede i tandfollikel (DF), som omgiver ubrudte tænder og forbliver til stede i periodontal ledbånd omkring roden, når tanden bryder ud1. ERM-celler, der er dyrket sammen med tandmasse, har vist sig at differentiere sig til ameloblastlignende celler og generere emaljelignende væv6. Imidlertid har dybtgående undersøgelser af ERM-cellernes specifikke rolle i emaljegenerering (re-) været begrænsede på grund af manglen på pålidelige undersøgelsesmodeller7. Nuværende ERM in vitro-kultursystemer hæmmes af begrænset levetid og hurtigt tab af fænotype under de 2D-betingelser, der normalt anvendes 8,9,10,11,12. Derfor er der et stærkt behov for et medgørligt in vitro-system til trofast at udvide, studere og differentiere humane DESC’er.
I løbet af det sidste årti er en kraftfuld teknik til at dyrke epitelstamceller in vitro med succes blevet anvendt på flere typer (humane) epitelvæv for at studere deres biologi såvel som sygdom 13,14,15,16. Denne teknologi gør det muligt for vævsepitelstamcellerne at udvikle sig selv til 3D-cellekonstruktioner (dvs. organoider), når de podes i et ekstracellulært matrix (ECM) -efterlignende stillads (typisk Matrigel) og dyrkes i et defineret medium, der replikerer vævets stamcelle niche signalering og / eller embryogenese. Typiske vækstfaktorer, der er nødvendige for organoid udvikling, omfatter epidermal vækstfaktor (EGF) og vingeløs type MMTV-integrationssted (WNT) aktivatorer 14,15,16. De resulterende organoider er kendetegnet ved varig troskab ved at efterligne vævets oprindelige epitelstamceller samt høj ekspanderbarhed, samtidig med at deres fænotype og funktionelle egenskaber bevares, hvorved den ofte begrænsede primære humane vævstilgængelighed som erhvervet fra klinikken bevares. For at etablere organoider er isolering af epitelstamcellerne fra det heterogene væv (dvs. omfattende andre celletyper såsom mesenkymale celler) før dyrkning ikke påkrævet, da mesenkymale celler ikke binder sig til eller trives i ECM, hvilket i sidste ende resulterer i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denne lovende og alsidige teknologi har ført til udviklingen af mangfoldige organoidmodeller fra forskellige humane epitelvæv. Imidlertid blev menneskelige tandafledte organoider, der er værdifulde til dyb undersøgelse af tandudvikling, regenerering og sygdom, endnu ikke etableret20,21. Det lykkedes os for nylig at udvikle en sådan ny organoidmodel, der starter fra DF-væv fra tredje kindtænder (visdomstænder) udtrukket fra unge patienter19.
Her beskriver vi protokollen til udvikling af epitelorganoidkulturer fra den voksne menneskelige tand (dvs. fra DF af tredje molarer) (figur 1A). De resulterende organoider udtrykker ERM-associerede stamhedsmarkører, mens de er langsigtede ekspanderbare. Interessant nok, modsat de fleste andre organoidmodeller, er den typisk nødvendige EGF overflødig for robust organoidudvikling og vækst. Interessant nok viser stamhedsorganoiderne ameloblastdifferentieringsegenskaber og efterligner derved ERM / DESC-funktioner og processer, der forekommer in vivo. Den nye og unikke organoidmodel, der er beskrevet her, gør det muligt at udforske DESC-biologi, plasticitet og differentieringskapacitet og åbner døren for at tage de første skridt mod tandregenerative tilgange.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver den effektive og reproducerbare generation af organoider startende fra den menneskelige tand. Så vidt vi ved, er dette den første metode til etablering af nuværende koncept (epitel) organoider startende fra humant tandvæv. Organoiderne kan udvides på lang sigt og viser en tandepitelstammefænotype, der duplikerer DESC’er, der tidligere er rapporteret i ERM-rummet i DF7. Desuden replikerer organoiderne funktionelle DESC/ERM-egenskaber, herunder udfoldelsen af en amelob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for alle medarbejdere i oral og maxillofacial kirurgi (MKA) i UZ Leuven, såvel som patienterne, for deres uvurderlige hjælp til at indsamle frisk ekstraherede tredje molarer. Vi vil også gerne takke Dr. Reinhilde Jacobs og Dr. Elisabeth Tijskens for deres hjælp med prøvesamlingen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra KU Leuven (BOF) og FWO-Flandern (G061819N). L.H. er ph.d.-stipendiat (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
