Etablering av organoider fra human tann som et kraftig verktøy mot mekanistisk forskning og regenerativ terapi
Summary
Vi presenterer en protokoll for å utvikle epiteliale organoidkulturer som starter fra menneskelig tann. Organoidene er robust utvidbare og rekapitulerer tannens epiteliale stamceller, inkludert deres ameloblast differensieringskapasitet. Den unike organoidmodellen gir et lovende verktøy for å studere human tann (stamcelle) biologi med perspektiver for tannregenereringsmetoder.
Abstract
Tenner er av avgjørende betydning i livet, ikke bare for matmastikering og tale, men også for psykologisk velvære. Kunnskap om menneskelig tannutvikling og biologi er knapp. Spesielt er ikke mye kjent om tannens epitelceller og deres funksjon. Vi lyktes i å utvikle en ny organoid modell som starter fra menneskelig tannvev (dvs. tannsekken, isolert fra ekstraherte visdomstenner). Organoidene er robust og langsiktig utvidbare og rekapitulerer det foreslåtte humane tannepitelformede stamcellerommet når det gjelder markøruttrykk samt funksjonell aktivitet. Spesielt er organoidene i stand til å utfolde en ameloblast differensieringsprosess som forekommer in vivo under amelogenesis. Denne unike organoidmodellen vil gi et kraftig verktøy for å studere ikke bare menneskelig tannutvikling, men også tannpatologi, og kan bane vei mot tannregenereringsterapi. Å erstatte tapte tenner med en biologisk tann basert på denne nye organoidmodellen kan være et tiltalende alternativ til dagens standard implantasjon av syntetiske materialer.
Introduction
Tenner har viktige roller i matmastikering, tale og psykologisk velvære (selvbilde). Den menneskelige tannen består av svært mineraliserte vev av varierende tetthet og hardhet1. Dental emalje, hovedkomponenten i tannkronen, er det høyeste mineraliserte vevet i menneskekroppen. Under emaljedannelse (amelogenese), når tennene utvikler seg, skiller tannepitelceller (DESC) seg i emaljedannende celler (ameloblaster). Når den er dannet, blir emaljen sjelden reparert eller fornyet på grunn av apoptotisk tap av ameloblastene ved utbruddet av tannutbrudd1. Restaurering av skadet emaljevev, som forårsaket av traumer eller bakteriell sykdom, oppnås for tiden ved hjelp av syntetiske materialer; Disse er imidlertid plaget med viktige mangler som mikroleakage, dårligere osseointegrasjon og forankring, begrenset levetid og mangel på fullt funksjonell reparasjon2. Derfor vil en robust og pålitelig kultur av menneskelige DESC-er med kapasitet til å generere ameloblaster og potensialet for å produsere mineralisert vev være et stort skritt fremover i tannregenereringsfeltet.
Kunnskap om human DESC fenotype og biologisk funksjon er knappe 3,4,5. Interessant nok har DESCer av menneskelige tenner blitt foreslått å eksistere i Epithelial Cell Rests of Malassez (ERM), celleklynger tilstede i tannsekken (DF), som omgir uoppløste tenner, og forblir til stede i periodontal ligament rundt roten når tannen bryter ut1. ERM-celler som er kokulturert med tannmasse har vist seg å skille seg ut i ameloblastlignende celler og generere emaljelignende vev6. Imidlertid har dype studier av den spesifikke rollen til ERM-celler i emalje (re-) generasjon vært begrenset på grunn av mangel på pålitelige studiemodeller7. Nåværende ERM in vitro kultursystemer er hemmet av begrenset levetid og raskt tap av fenotype i 2D-forholdene standard brukt 8,9,10,11,12. Derfor er et gjennomførbart in vitro-system for trofast å utvide, studere og differensiere menneskelige DESC-er sterkt nødvendig.
I løpet av det siste tiåret har en kraftig teknikk for å vokse epitelceller in vitro blitt brukt på flere typer (menneskelig) epitelvev for å studere deres biologi samt sykdom 13,14,15,16. Denne teknologien gjør det mulig for vev epitelceller å selvutvikle seg til 3D-cellekonstruksjoner (dvs. organoider) når de frøes til en ekstracellulær matrise (ECM)-etterlignende stillas (vanligvis Matrigel) og dyrket i et definert medium som replikerer vevets stamcellenisjesignalering og / eller embryogenese. Typiske vekstfaktorer som trengs for organoid utvikling inkluderer epidermal vekstfaktor (EGF) og wingless-type MMTV integrasjonssted (WNT) aktivatorer 14,15,16. De resulterende organoidene er preget av varig troskap i å etterligne vevets opprinnelige epitelceller, samt høy utvidbarhet samtidig som de beholder sin fenotype og funksjonelle egenskaper, og overvinner dermed den ofte begrensede primære menneskelige vevstilgjengeligheten som er anskaffet fra klinikken. For å etablere organoider er det ikke nødvendig å isolere de epiteliale stamcellene fra det heterogene vevet (dvs. bestående av andre celletyper som mesenchymale celler) før culturing, da mesenchymale celler ikke festes til, eller trives i, ECM, noe som til slutt resulterer i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denne lovende og allsidige teknologien har ført til utvikling av mangfoldige organoidmodeller fra ulike menneskelige epitelvev. Imidlertid ble menneskelige tannavledede organoider, verdifulle for dyp studie av tannutvikling, regenerering og sykdom, ikke etablert ennå20,21. Vi lyktes nylig i å utvikle en så ny organoid modell som starter fra DF vev fra tredje molarer (visdomstenner) ekstrahert fra ungdomspasienter19.
Her beskriver vi protokollen for å utvikle epitelorganoidkulturer fra den voksne menneskelige tannen (dvs. fra DF av tredje molarer) (figur 1A). De resulterende organoidene uttrykker ERM-assosierte stemnessmarkører samtidig som de er langsiktige utvidbare. Interessant, motsatt av de fleste andre organoidmodeller, er den typisk nødvendige EGF overflødig for robust organoid utvikling og vekst. Interessant nok viser stemness organoider ameloblast differensieringsegenskaper, og etterligner dermed ERM / DESC-funksjoner og prosesser som forekommer in vivo. Den nye og unike organoidmodellen som er beskrevet her, gjør det mulig å utforske DESC-biologi, plastisitet og differensieringskapasitet og åpner døren for å ta de første skrittene mot tannregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver den effektive og reproduserbare generasjonen organoider som starter fra den menneskelige tannen. Så vidt vi vet er dette den første metoden for å etablere nåværende konsept (epiteliale) organoider som starter fra humant tannvev. Organoidene er langsiktige utvidbare og viser en tannepitelemi fenotype, dupliserende DESC-er som tidligere er rapportert i ERM-rommet i DF7. Videre replikerer organoidene funksjonelle DESC / ERM-egenskaper, inkludert utfoldelse av en amelo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til alle ansatte ved Oral and Maxillofacial Surgery (MKA) i UZ Leuven, så vel som pasientene, for deres uvurderlige hjelp til å samle nyutpakkede tredje molarer. Vi vil også takke Dr. Reinhilde Jacobs og Dr. Elisabeth Tijskens for deres hjelp med prøvesamlingen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra KU Leuven (BOF) og FWO-Flandern (G061819N). L.H. er en FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
