Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren
Summary
Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.
Abstract
Het ontbreken van een robuust in vitro model van het menselijke respiratoire epitheel belemmert het begrip van de biologie en pathologie van het ademhalingssysteem. We beschrijven een gedefinieerd protocol om menselijke longorganoïden af te leiden van volwassen stamcellen in het longweefsel en proximale differentiatie te induceren om volwassen luchtwegorganoïden te genereren. De longorganoïden worden vervolgens achtereenvolgens gedurende meer dan 1 jaar met hoge stabiliteit uitgebreid, terwijl de gedifferentieerde luchtwegorganoïden worden gebruikt om morfologisch en functioneel menselijk luchtwegepitheel te simuleren tot een bijna fysiologisch niveau. Zo stellen we een robuust organoïde model van het menselijke luchtwegepitheel vast. De langdurige expansie van longorganoïden en gedifferentieerde luchtwegorganoïden genereert een stabiele en hernieuwbare bron, waardoor wetenschappers de menselijke luchtwegepitheelcellen in kweekschotels kunnen reconstrueren en uitbreiden. Het menselijke longorganoïde systeem biedt een uniek en fysiologisch actief in vitro model voor verschillende toepassingen, waaronder het bestuderen van virus-gastheer interactie, medicijntesten en ziektemodellering.
Introduction
Organoïden zijn een robuust en universeel hulpmiddel geworden voor in vitro modellering van orgaanontwikkeling en het bestuderen van biologie en ziekte. Wanneer gekweekt in een groeifactor-gedefinieerd kweekmedium, kunnen volwassen stamcellen (ASC) uit een verscheidenheid aan organen worden uitgebreid in 3-dimensie (3D) en zelf worden geassembleerd tot orgaanachtige cellulaire clusters die zijn samengesteld uit meerdere celtypen, organoïden genoemd. Het laboratorium van Clevers rapporteerde de afleiding van de eerste asc-afgeleide organoïde, human intestinal organoid, in 2009 1,2. Daarna zijn asc-afgeleide organoïden vastgesteld voor een verscheidenheid aan menselijke organen en weefsels, waaronder prostaat 3,4, lever 5,6, maag 7,8,9, pancreas10, borstklier11 en long 12,13 . Deze van ASC afgeleide organoïden behielden de kritische cellulaire, structurele en functionele eigenschappen van het inheemse orgaan en behielden genetische en fenotypische stabiliteit in de expansiecultuur op lange termijn14,15.
Organoïden kunnen ook worden afgeleid van pluripotente stamcellen (PSC), waaronder embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel16. Terwijl PSC-afgeleide organoïden de mechanismen van orgaanontwikkeling voor hun oprichting exploiteren, kunnen ASC’s worden gedwongen om organoïden te vormen door omstandigheden te herbouwen die de stamcelniche nabootsen tijdens fysiologische weefselzelfvernieuwing of weefselherstel. PSC-afgeleide organoïden zijn gunstige modellen om ontwikkeling en organogenese te onderzoeken, hoewel ze niet in staat zijn om het vergelijkbare rijpingsniveau van ASC-afgeleide organoïden te bereiken. De foetale rijpingsstatus van PSC-afgeleide organoïden en de complexiteit voor het vaststellen van deze organoïden verhinderen aanzienlijk hun brede toepassingen voor het bestuderen van biologie en pathologie in volwassen weefsels.
De menselijke luchtwegen, van neus tot terminale bronchiole, zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook wel het pseudostratified trilhaarepitheel genoemd, dat bestaat uit vier belangrijke celtypen, d.w.z. trilhaarcel, bokaalcel, basale cel en clubcel. We hebben de ASC-afgeleide menselijke longorganoïde uit menselijke longweefsels vastgesteld in samenwerking met Clevers ‘ lab12,13. Deze longorganoïden worden gedurende meer dan een jaar achtereenvolgens in het expansiemedium geëxpandeerd; de precieze duur varieert tussen de verschillende organoïde lijnen die van verschillende donoren zijn verkregen. In vergelijking met het inheemse luchtwegepitheel zijn deze langdurig uitbreidbare longorganoïden echter niet volwassen genoeg omdat trilhaarcellen, de belangrijkste celpopulatie in de menselijke luchtwegen, ondervertegenwoordigd zijn in deze longorganoïden. Zo ontwikkelden we een proximaal differentiatieprotocol en genereerden we 3D- en 2D-luchtwegorganoïden die morfologisch en functioneel fenoscopie van het luchtwegepitheel tot een bijna-fysiologisch niveau.
Hier bieden we een videoprotocol om menselijke longorganoïden af te leiden uit de primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De menselijke luchtwegen zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook bekend als het pseudostratified ciliated epithelium. De belangrijkste celtypen van het bovenste luchtwegepitheel zijn trilhaarcellen die de gecoördineerde beweging van hun apicale trilharen mogelijk maken om slijm en ingeademde deeltjes uit de luchtwegen te verdrijven, bokaalcellen die slijm produceren en afscheiden, en basale cellen die het keldermembraan bekleden en betrokken zijn bij regeneratie. In de kleine luchtweg zoals bronchiolen bevat het kubu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken het Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, voor hulp bij confocale beeldvorming en flowcytometrie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van het Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) van het Food and Health Bureau; Algemeen Fonds voor Onderzoek (GRF, 17105420) van de Raad voor Onderzoeksbeurzen; en Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, de regering van de speciale administratieve regio Hongkong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
