उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना
Summary
प्रतिदीप्ति सेंसर के लिए युग्मित उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी को निर्धारित करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर और आरओएस उत्पादन का आकलन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
परिधीय तंत्रिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता परिधीय न्यूरोपैथी से जुड़ी कई बीमारियों के साथ होती है, जिसे ऑटोइम्यून बीमारियों, मधुमेह, संक्रमण, विरासत में मिले विकारों और ट्यूमर सहित कई कारणों से ट्रिगर किया जा सकता है। माउस परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना छोटे नमूना आकार, ऊतक में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया की सीमित संख्या और माइलिन म्यान की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस काम में वर्णित तकनीक ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बजाय कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए मांसपेशियों के तंतुओं के लिए उपयोग किए जाने वाले एक से अनुकूलित एक अद्वितीय पारगम्यता प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन चुनौतियों को कम करती है। पेरोक्सीडेज के साथ फ्लोरिमेट्रिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन को मापने और सैपोनिन-पारगम्य नसों में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट और अवरोधकों की तुलना करके, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), और माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों की गतिविधि का एक साथ पता लगाना संभव था। इसलिए, यहां प्रस्तुत विधि अन्य तकनीकों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मूल्यांकन की तुलना में फायदे प्रदान करती है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका व्यवहार्यता को बनाए रखने और ऊर्जा चयापचय (ग्लूकोज, अमीनो एसिड, लिपिड और न्यूक्लियोटाइड चयापचय मार्ग) जैसे कई सेल कार्यों को करने के लिए आवश्यक हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन की प्राथमिक साइट के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया एपोप्टोसिस जैसी कई सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में केंद्रीय हैं और लौह-सल्फर (एफई-एस) क्लस्टर, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात और परिपक्वता के संश्लेषण में भाग लेते हैं, और उनके जीनोम और राइबोसोम 1,2,3 के रखरखाव में भाग लेते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता नेटवर्क को संलयन और विखंडन प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और उनके पास गुणवत्ता नियंत्रण और माइटोफैगी 4,5,6 के लिए मशीनरी भी होती है।
माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता कैंसर, मधुमेह और मोटापे जैसी कई रोग स्थितियों की उपस्थिति से जुड़ी हुई है7. माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में गड़बड़ी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में पाई जाती है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करती है, जैसे अल्जाइमर रोग 8,9, पार्किंसंस रोग10,11, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस 12,13, और हंटिंगटन रोग14,15 . परिधीय तंत्रिका तंत्र में, अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का नुकसान प्रतिरक्षा न्यूरोपैथी में देखा जाता है, जैसे कि गुइलेन-बैरे सिंड्रोम16,17, और अक्षतंतु में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन के सहयोग से, ये घटनाएं श्वान कोशिकाओं18 में एमएपी किनेज सक्रियण का कारण बनती हैं। यह दर्शाता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी न केवल साइट-विशिष्ट सेल के लिए, बल्कि पूरे ऊतक के लिए आवश्यक हो सकती है। एचआईवी से जुड़े डिस्टल संवेदी पॉलीन्यूरोपैथी (एचआईवी-डीएसपी) में, माइटोकॉन्ड्रिया की तंत्र में एक भूमिका होती है जिसके द्वारा प्रतिलेखन (एचआईवी-टीएटी) प्रोटीन का ट्रांस-एक्टिवेटर एचआईवी को कुशलतापूर्वक दोहराने की अनुमति देता है, साथ ही साथ एचआईवी संक्रमण रोगजनन19,20 में कई अन्य भूमिकाएं भी।
कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान का मूल्यांकन न्यूरोपैथी 7,21,22 की जांच के लिए एक आवश्यक लक्ष्य के रूप में उभरा है। मधुमेह न्यूरोपैथी में, प्रोटिओमिक और चयापचय विश्लेषण से पता चलता है कि मधुमेह में अधिकांश आणविक परिवर्तन कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और लिपिड चयापचय को प्रभावित करतेहैं 7. ये परिवर्तन मोटापे से प्रेरित मधुमेह के शुरुआती संकेत भी प्रतीत होते हैं21. कीमोथेरेपी-प्रेरित दर्दनाक न्यूरोपैथी के एक माउस मॉडल में, कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल हानि को ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन22 में कमी और माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स गतिविधियों, झिल्ली क्षमता और एटीपी सामग्री23 की कमी के रूप में पाया जाता है। हालांकि, हालांकि कई समूहों ने न्यूरोपैथी में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का हवाला दिया है, ये अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के संरक्षण के बिना माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों में गतिविधि के माप तक सीमित हैं, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता के मूल्यांकन या माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के लिए एक पैरामीटर के रूप में एटीपी सामग्री के माप की कमी है। सामान्य तौर पर, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन के उचित मूल्यांकन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की आवश्यकता होती है विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन एक परकोल / माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक के लिए एक सीमित कारक भी हो सकता है क्योंकि बड़ी मात्रा में आवश्यक ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया हानि और व्यवधान।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान को माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और कटिस्नायुशूल तंत्रिका में आरओएस उत्पादन के रूप में मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को संरक्षित करना और माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की आवश्यकता के बिना। इस प्रोटोकॉल को उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति (एचआरआर) द्वारा पारगम्य मांसपेशी फाइबर24 में ऑक्सीजन की खपत माप से अनुकूलित किया गया है। इस प्रक्रिया के फायदे कटिस्नायुशूल तंत्रिका जैसे ऊतक की छोटी मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन करने और सीटू में माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों का मूल्यांकन करने की संभावना है, जिससे शारीरिक रूप से भरोसेमंद परिणाम प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पर्यावरण, संरचना और बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को संरक्षित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों को माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स और साइटोक्रोम सी गुणांक का ठीक से आकलन करने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता के बाद सब्सट्रेट और अवरोधकों के साथ निर्धारित किया गया था, जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ईटीएस) मूल्यांकन और आवश्यक मापदंडों की गणना के चरणों के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करता है। यह अध्ययन पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र में सवालों के जवाब देने के लिए उपकरण प्रदान कर सकता है जिसमें कटिस्नायुशूल तंत्रिका चयापचय को फंसाया जाता है, जैसे कि परिधीय न्यूरोपैथी।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूरोपैथी के साथ कई बीमारियों या स्थितियों में जोखिम कारक के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता होती है। परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन यह स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है कि माइटो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो सेरापिलहेरा, फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (एफएपीईआरजे), कॉन्सेल्हो नैशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो सिएंटिफिको ई टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू) और कोर्डेनाकाओ डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोल डी निवेल सुपीरियर-ब्रासिल द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम प्रयोगशाला सुविधाओं के साथ समर्थन के लिए डॉ एंटोनियो गैलिना फिल्हो, डॉ मोनिका मोंटेरो लोमेली और डॉ क्लाउडियो मसूदा और लेख में सुधार में दयालु और मूल्यवान टिप्पणियों के लिए डॉ मार्था सोरेनसन के आभारी हैं।
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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